Composición fitoquímica y actividad antibacteriana de extractos clorofórmicos de las hojas de Cassia uniflora Mill

ARTÍCULO DE REVISIÓN

 

Composición fitoquímica y actividad antibacteriana de los extractos clorofórmicos de las hojas de Cassia uniflora Mill

 

Phytochemical composition and antibacterial activity of chloroform extracts of Cassia uniflora Mill leaves

 

 

José Angel Morales León,1 Dilver Peña Fuentes,1 Eugenio Torres Rodríguez,1 Robinson Hermosilla Espinosa,1 Annielys Fonseca García,2 Mercedes Saborit Armas,3

1 Centro de Estudios de Química Aplicada. Facultad de Ciencias Técnicas. Universidad de Granma. Cuba.
2 Cátedra de Ciencias Preclínicas. Facultad de Ciencias Médicas "Celia Sánchez Manduley". Universidad de Ciencias Médicas de Granma.
3 Departamento de Química. Facultad de Educación Media. Universidad de Granma.

 

 

RESUMEN

Introducción: Los metabolitos aislados de las plantas pueden variar según el método de extracción aplicado. Las hojas de Cassia uniflora Mill contienen terpenoides, esteroides y polifenoles con efecto alelopático, larvicida, analgésico, antiinflamatorio y antiartrítico. La actividad antibacteriana ha sido poco estudiada.
Objetivo: Determinar la composición fitoquímica y la actividad antibacteriana fundamental de los extractos clorofórmicos de las hojas de C. uniflora obtenidos mediante maceración y extracción por Soxhlet.
Métodos: Se pulverizaron las hojas secas de la planta para obtener extractos clorofórmicos mediante los métodos de maceración y de Soxhlet. Se calculó el rendimiento de cada extracción, se analizó la composición mediante el tamizaje fitoquímico y la cromatografía de capa delgada, y se evaluó la actividad antibacteriana mediante el método de difusión en agar por medio de la diseminación superficial en disco.
Resultados: El rendimiento de la maceración fue mayor que el que se obtuvo mediante el método de Soxhlet. En el primer extracto se detectaron quinonas, antraquinonas, cumarinas y flavonoides; en el segundo, cumarinas y flavonoides. Ambos extractos presentaron actividad frente a las cepas de bacterias grampositivas y fueron inactivos frente a las de bacterias gramnegativas.
Conclusiones: Los dos extractos presentaron actividad antibacteriana, por tanto, ambos métodos de extracción pueden ser usados para obtener principios activos de las hojas de C. uniflora. Las diferencias en la composición fitoquímica indican que las cumarinas y los flavonoides influyen en la actividad biológica.

Palabras clave: Cassia uniflora; extracciones clorofórmicas; composición fitoquímica; actividad antibacteriana.

ABSTRACT

Introduction: Metabolites isolated from plants may vary depending on the extraction method applied. Cassia uniflora Mill leaves contain terpenoids, steroids and polyphenols with allelopathic, larvicidal, analgesic, antiinflammatory and antiarthritic activitiy. Their antibacterial activity has not been thoroughly studied.
Objective: Determine the phytochemical composition and fundamental antibacterial activity of C. uniflora chloroform leaves extracts obtained by maceration and Soxhlet extraction.
Methods: Dry leaves of the study plant were pulverized to obtain chloroform extracts by maceration and Soxhlet extraction. The yield of each extraction was calculated. Composition was analyzed by phytochemical screening and thin layer chromatography. Antibacterial activity was evaluated by the agar disc diffusion test.
Results: The yield of maceration was greater than that of the Soxhlet method. The former extract was found to contain quinones, anthraquinones, coumarins and flavonoids, whereas the latter contained coumarins and flavonoids. Both extracts displayed activity against gram-positive bacterial strains, and were inactive against gram-negative bacteria.
Conclusions: The two extracts displayed antibacterial activity. Therefore, both extraction methods may be used to obtain active compounds from C. uniflora leaves. The differences observed in phytochemical composition suggest that coumarins and flavonoids have an influence on biological activity.

Key words: Cassia uniflora, chloroform extraction, phytochemical composition, antibacterial activity.

 

 

INTRODUCCIÓN

Cassia uniflora Mill (sin. Senna uniflora) es una planta con varios nombres comunes: cafetillo (este de Cuba), hierba hedionda, guanina, platanillo (Cuba), 1 cacahuatillo, xtulub, frijolillo (México), tulub-bayam, tulub-bi-yan, xtuab, x-tuab, bu'ul ch'o' k'aax (pueblos mayas), chipilín, ovilla (Dakota del Norte, Estados Unidos de América).2

Las hojas de C. uniflora contienen terpenoides, esteroides, flavonoides, ésteres alifáticos y aceites esenciales amargos y purgantes, relacionados con las actividades alelopática y larvicida contra Aedes aegypti.3-5 En los extractos etanólicos y etéreos se han identificado varios polifenoles, entre ellos, flavonoides, antocianidinas, quinonas y cumarinas apolares.6

La cantidad y los tipos de metabolitos secundarios pueden variar según los solventes y los métodos de extracción utilizados, lo que da lugar a variaciones en la actividad biológica.7 El cloroformo se ha utilizado con frecuencia para obtener extractos vegetales mediante maceración y mediante el método de Soxhlet. Los productos obtenidos se han sometido a investigaciones de la composición fitoquímica y la actividad biológica, y se ha llegado a resultados alentadores.8-10

La actividad biológica más estudiada de los polifenoles es la antioxidante, aunque se ha documentado la actividad antimicrobiana contra bacterias patógenas.11-13 El mecanismo de toxicidad bacteriana de estos compuestos está relacionado con la inhibición de enzimas hidrolíticas (proteasas y carbohidrolasas), la inactivación de adhesinas bacterianas, las proteínas membranales de transporte y las interacciones con glúcidos.14

En la medicina tradicional, C. uniflora se usa en el tratamiento de la artritis, dolores espasmódicos, erupciones cutáneas, inflamaciones, infecciones y dismenorrea.15-17 Los extractos obtenidos de las hojas tienen actividad analgésica, antiinflamatoria y antiartrítica.18

Aunque C. uniflora se ha usado en el tratamiento empírico de infecciones microbianas,17 los reportes de estudios de la actividad antibacteriana de los extractos de las hojas u otras partes de esta planta son escasos.

Este trabajo está dirigido a determinar la composición fitoquímica y la actividad antibacteriana de los extractos clorofórmicos de las hojas de C. uniflora obtenidos por maceración y por extracción mediante el método de Soxhlet.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

La biomasa se recolectó y clasificó según la Norma Ramal 309 del Ministerio de Salud Pública de la República de Cuba. 19 Un ejemplar representativo se autentificó en el Jardín Botánico Cupaynicú de Guisa, Granma (número de Voucher: 2803).

Se tomaron muestras de hojas de plantas adultas que se lavaron con agua potable y una solución de hipoclorito de sodio al 2 %20-22 y se secaron a la sombra sobre planchas de cartón perforadas durante una semana removiendo el material dos veces al día, y luego en una estufa (WSU 400, Alemania) con circulación de aire a 40 °C durante 1 día. Se obtuvo un polvo empleando un molino eléctrico (SWM 4, Alemania) y un tamiz circular (TGL 0-4188 WEB, Alemania).

Extracción por maceración

Se colocaron en un frasco de color ámbar de 250 mL 10 g del polvo obtenido y se adicionaron 50 mL de cloroformo, se tapó herméticamente y se agitó en zaranda (Thys 2 MLW, Alemania) a 60 rpm durante 24 h. Se dejó en reposo por 2 h (T= 4-8 °C), después se filtró a presión reducida y se concentró el filtrado hasta lograr la sequedad en un rotoevaporador (IKA RV 05-ST, Alemania).

Extracción con el método de Soxhlet

Se utilizó un extractor de Soxhlet compuesto por: un balón de 500 mL al que se le adicionaron 100 mL de cloroformo y que sirvió como sistema colector, un dedal de papel de filtro con 10 g del polvo de las hojas, un condensador como refrigerante y un extractor con capacidad de 50 mL. El extractor se conectó a un recirculador de agua para la condensación (VEB MLW U7C, Alemania) y como fuente de calentamiento se empleó un baño con termostato (SC-15, China) ajustado a la temperatura de ebullición del cloroformo (61-62 °C). Los vapores de cloroformo se hicieron pasar varias veces a través del dedal durante 8 h. El extracto obtenido se secó siguiendo un procedimiento similar al de la extracción por maceración.

Rendimiento de las extracciones

Se compararon los rendimientos obtenidos con los dos métodos aplicados para obtener los extractos utilizando la expresión:

Donde:

Rc: Rendimiento de extracción obtenido

mc: Masa recuperada en la extracción efectuada

mDS: Masa de la droga seca

 

Análisis fitoquímico

Se emplearon métodos estandarizados de tamizaje fitoquímico que, apoyados en el análisis por fluorescencia bajo luz visible (vis.) y ultravioleta (UV) permitieron determinar los metabolitos secundarios en los extractos evaluados.23-28 La prueba del reactivo alcalino para determinar polifenoles26 fue modificada: la solución acuosa del extracto seco fue tratada en este caso con una mezcla de NH4OH 12 % y NaOH 2 %. La fluorescencia amarilla se reconoció como señal de la presencia de flavonoides.

Cromatografía en capa delgada (CCD)

Se emplearon cromatofolios de 7 cm de largo por 3 cm de ancho en soporte de aluminio, de gel de sílice 60, F254, espesor 0,2 mm (Merck, Alemania). Se depositaron alícuotas de los extractos en las placas preparadas. La corrida se realizó utilizando como fase móvil una mezcla de tolueno-acetato de etilo 3:1 (v/v). Las placas se secaron a temperatura ambiente y la separación de los componentes se visualizó en vis. y UV (l= 254 nm, l= 365 nm).

Los resultados de la CCD se definieron según el grado de retención de los compuestos separados en la superficie del cromatofolio y se expresaron como el índice de retención ( Rf) de cada mancha definida, calculado mediante la expresión:

Donde

Di : distancia de desplazamiento del componente i

Ddis : distancia de desplazamiento de la fase móvil

Ensayos antibacterianos

Seevaluó la actividad antibacteriana mediante el método de difusión en agar por diseminación superficial en disco. 29 Se utilizaron 3 cepas estandarizadas depositadas en "American Type Culture Collection" (ATCC): Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC 113-3), Bacillus subtilis (ATCC 6633) y una cepa salvaje (Staphylococcus aureus sp.1) aislada de un paciente en el Hospital Provincial Clínico Quirúrgico "Celia Sánchez Manduley" de Manzanillo, Cuba.

Los extractos secos obtenidos mediante los dos métodos de extracción empleados se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO). La concentración final en los discos fue de 1 mg/disco.

Se aplicaron 5 tratamientos con 3 réplicas cada uno, y se utilizaron como controles negativos discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro cargados con 5 µL de DMSO; y como controles positivos, discos de los antibióticos comerciales Gentamicina (GN) y Ciprofloxacina (CF) de 30 y 5 µg/disco, respectivamente. La variable medida fue el diámetro del halo de inhibición (DI, mm), y los resultados se declararon como el promedio del diámetro de los halos de inhibición para cada tratamiento.

Análisis estadístico

Se aplicó el procedimiento de análisis de varianza. Los resultados de los análisis se obtuvieron con el software STATISTICA (Trial versión 8.0, Statsoft Inc., EE. UU.). Una vez detectadas las diferencias estadísticas significativas entre los diversos tratamientos, se llevó a cabo un análisis de rangos de pares de medias por el método de Tukey. El cálculo de la probabilidad para los análisis realizados fue del 95 % de confianza.

 

RESULTADOS

En la tabla 1 se muestran los rendimientos de los extractos de las hojas de C. uniflora obtenidos mediante los dos métodos a partir de 10 g del polvo en cada caso.

El tamizaje fitoquímico muestra diferencias en la composición de ambos extractos (tabla 2).

El análisis de la composición fitoquímica se corroboró mediante CCD (fig.) y los valores de Rf, así como los colores de cada mancha detectada se muestran en la tabla 3.

Se detectaron cumarinas simples: fluorescencia gris-azul en vis. (fig A), rosado en UV l= 254 nm (fig. B), azul en UV l=365 nm (fig C); furano y piranocumarinas: amarillo, azul, anaranjado y marrón en UV l=365 nm (fig C); antraquinonas con fluorescencia amarillo-naranja en vis. (fig A) y rojo-marrón y amarillo en UV l=365 nm (fig C); quinonas: marrón en vis. (fig A) y carmelita en UV l=365 nm (fig C); y flavonoides: fluorescencia amarilla en vis. (fig A) que pasa a azul oscuro en UV l=254 nm (fig B), y a amarilla y azul en UV l=365 nm (fig C).

La actividad antibacteriana frente a cuatro cepas mostró resultados similares en los dos extractos. Fueron inactivos frente a P. aeruginosa y E. coli e inhibieron los crecimientos de S. aureus y B. subtilis. Sin embargo, existen diferencias significativas en la actividad de ambos extractos (tabla 4).

 

DISCUSIÓN

El extracto clorofórmico obtenido por maceración mostró mayor rendimiento que el obtenido por Soxhlet. Aunque la extracción de metabolitos secundarios mediante el método de Soxhlet consume menos tiempo y solvente que una maceración, también tiene sus desventajas. El hecho de que la muestra esté en constante calentamiento a la temperatura de ebullición del disolvente empleado (en este caso cloroformo, 61-62 °C), puede provocar la descomposición de los compuestos termolábiles,30 y dar lugar a otros compuestos volátiles que pueden perderse, lo cual disminuye el rendimiento. Los bajos valores de la masa recuperada con cada método confirman los resultados obtenidos con anterioridad sobre el superioridad de los compuestos polares en las hojas de C. uniflora.6

En los dos extractos se detectaron cumarinas y flavonoides, lo cual coincide con un reporte anterior.6 En la maceración se detectaron quinonas no así en el otro extracto, lo que puede estar relacionado con la diferencia de temperatura; con el método de Soxhlet la mayor temperatura pudo provocar la transformación de metabolitos, lo que causó resultados negativos en los ensayos de identificación de quinonas.

Las quinonas reconocidas son naftoquinonas y antraquinonas, pues en la reacción de Bornträger forman complejos rojo cereza y violeta al ser tratadas con NH4OH.31

La presencia de flavonoides se corroboró mediante CCD, y se detectaron manchas amarillas y en dos tonos de azul, típicas en estos metabolitos secundarios.25-26 En este grupo, los colores de las flavonas, los flavonoles y las auronas cambian desde el amarillo tenue hasta el rojo debido al sistema conjugado que presentan en su estructura.32

Los colores observados en vis. (azul-violáceo, rosado y verde claro) coinciden con el comportamiento de flavonoides y cumarinas en esta longitud de onda.25 La mezcla de varios compuestos, cercana al punto de aplicación, con predominio del marrón, demuestra la existencia de compuestos de base fenólica como flavonoides, quinonas y cumarinas.25,32

Las quinonas son capaces de pasar del marrón en vis. al carmelita a 365 nm, mientras que las cumarinas se tornan azul en vis., pasan a rosado a 254 nm y a azul a 365 nm (cumarinas simples) y a amarillo, azul o marrón (furanocumarinas y piranocumarinas) a 365 nm, mientras que las naftoquinonas y antraquinonas exhiben azul y gris.25 En el caso particular de las antraquinonas, los colores detectados coinciden con los que han sido reportados para los grupos de las antronas y los antranoles. 25 Según su estructura, los flavonoides pueden aparecer en zonas fluorescentes a 365 nm en amarillo oscuro, azul o verde, estos colores se intensifican con la aplicación de reactivos reveladores.32

Las diferencias significativas de la actividad antibacteriana entre los extractos pueden explicarse teniendo en cuenta el efecto de la temperatura sobre la estabilidad de los metabolitos extraídos con el método de Soxhlet, lo cual provoca la degradación de los metabolitos activos y la consecuente disminución de la actividad del extracto. Por tanto, la temperatura es un factor importante que hay que tener en cuenta en el momento de aislar los principios activos naturales. Ambos extractos fueron inactivos frente a las bacterias gramnegativas P. aeruginosa y E. coli. Este tipo de bacterias son más resistentes frente a los antimicrobianos de forma general, debido a componentes específicos presentes en sus paredes celulares.33

Pese a las diferencias en el rendimiento, la composición fitoquímica y la actividad antibacteriana de los extractos obtenidos por maceración y Soxhlet, ambos extractos presentaron actividad promisoria frente a las cepas de bacterias grampositivas evaluadas, de modo que ambos métodos de extracción pueden ser usados para obtener productos bioactivos a partir de las hojas de C. uniflora. Según el análisis conjunto de la composición fitoquímica y la actividad antibacteriana, los flavonoides y las cumarinas son los metabolitos que están implicados en la actividad antibacteriana de los extractos clorofórmicos de las hojas de C. uniflora.

 

Agradecimientos

Agradecemos al Servicio Alemán de Intercambio Académico (DAAD, siglas en alemán) y al Instituto de Química de la Universidad de Rostock en Alemania, por el apoyo técnico-material brindado en la realización de este trabajo.

Declaración de conflictos

No existen conflictos de intereses entre los autores.

 

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Recibido: 7 de mayo de 2016
Aprobado: 25 de abril de 2018

 

 

José Angel Morales León . Centro de Estudios de Química Aplicada. Facultad de Ciencias Técnicas. Universidad de Granma. Cuba.
Correo electrónico: jmorales@udg.co.cu

 



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