Actividad antiproliferativa y estrogénica de un extracto de Ginkgo biloba L. en ratas con hiperplasia prostática benigna

Luz Irene Pascual Mathey; Enrique Juárez Aguilar; Salma Dahí López Lara; José Locia Espinoza; Juana Ramírez Aguilera; Clara Elena Yerena Aguilar

Actividad antiproliferativa y estrogénica de un extracto de Ginkgo biloba L. en Ratas con hiperplasia prostática benigna

ARTÍCULO ORIGINAL

Actividad antiproliferativa y estrogénica de un extracto de Ginkgo biloba L. en ratas con hiperplasia prostática benigna

Anti-proliferative and estrogenic activity of a Ginkgo biloba L. extract in rats with benign prostatic hyperplasia

Luz Irene Pascual Mathey,^I Enrique Juárez Aguilar,^II Salma Dahí López Lara,^I José Locia Espinoza,^I Juana Ramírez Aguilera,^I Clara Elena Yerena Aguilar^I

^I Facultad de Química Farmacéutica Biológica, Universidad Veracruzana. Veracruz, México.
^II Instituto de Ciencias de la Salud. Veracruz, México.

RESUMEN

Introducción: La hiperplasia prostática benigna (HPB) se caracteriza por la proliferación no cancerosa de las células prostáticas en los hombres de edad avanzada. Las estrategias terapéuticas actuales, aunque efectivas, pueden provocar efectos adversos. El extracto estandarizado de Ginkgo biloba L. (EGb, Vasodil®) es un fitomedicamento que ha demostrado poseer actividad estrogénica y antiproliferativa en diferentes líneas de cáncer.
Objetivo: Evaluar la eficacia del extracto en un modelo de hiperplasia inducido mediante la administración de propionato de testosterona (PT).
Métodos: Se utilizaron 42 ratas macho de la línea Wistar con 250-300 g de peso. Las ratas fueron distribuidas en 7 grupos de 6 individuos cada uno: 1) grupo control (agua estéril [10 U, v.o.], y aceite mineral [10 U, s.c.]), 2) HPB (PT, 3 mg kg^-1día, s.c.), 3) FT (PT y finasterida [10 mg kg^-1 día, v.o.]), 4-7) EGb (PT y EGb 40, 80, 160 y 320 mg kg^-1día, v.o.). Las ratas se pesaron semanalmente durante el tratamiento. Después de 4 semanas, se obtuvo la sangre mediante punción cardiaca para cuantificar el estradiol (Kit Calbiotech); se pesó la próstata y se separó en sus lóbulos ventral [PV] y dorsolateral [PDL]. Una sección se utilizó para el análisis histológico utilizando la técnica de hematoxilina y eosina (H & E), la otra sección se homogeneizó para analizar la expresión del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) mediante western blot.
Resultados: La administración del EGb [160 mg/kg^-1] redujo notablemente tanto el peso en fresco como la expresión del antígeno nuclear de proliferación celular en la próstata dorsolateral de las ratas con inducción de hiperplasia prostática benigna, efecto que se relacionó con la disminución de las concentraciones séricas de estradiol y con la morfología alveolar prostática.
Conclusiones: Se evaluó la eficacia del extracto de Ginkgo biloba L. y se demostró su actividad antiproliferativa y estrogénica en un modelo de hiperplasia prostática benigna.

Palabras clave: Ginkgo biloba L.; hiperplasia prostática benigna; prevención; fitomedicamento.

ABSTRACT

Introduction: Benign prostatic hyperplasia (BPH) is characterized by by noncancerous proliferation of prostate cells in men of advanced age. Current therapeutic strategies, though effective, can cause adverse effects. The standardized Ginkgo biloba L. extract (EGb, Vasodil®) has shown to have estrogenic and anti-proliferative activity on different cancer lines.
Objective: Evaluate the efficacy of the extract in a model of hyperplasia induced by administration of testosterone propionate (PT).
Methods: The study sample was 42 male Wistar rats weighing 250-300 g. The rats were divided into 7 groups of 6 individuals each: 1) control group (sterile water [10 U, v.o.] and mineral oil [10 U, s.c.]).; 2) BPH (TP, 3 mg kg-1 day, s.c.); 3) FT (TP and finasteride [10 mg kg-1 day, v.o.]).; 4-7) GbE (TP and GbE 40, 80, 160 and 320 mg kg-1 day, v.o.). The rats were weighed weekly during the treatment. After 4 weeks, blood was obtained by cardiac puncture for estradiol quantitation (Kit Calbiotech). The prostate was weighed and split into its ventral [PV] and dorsolateral [PDL] lobes. One section was used for histological analysis by hematoxylin and eosin (H&E) staining. The other section was homogenized for analysis of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression by western blot.
Results: Administration of Gb extract [160 mg kg^-1] significantly reduced fresh weight and proliferating cell nuclear antigen expression in the dorsolateral prostate lobe of rats with induced benign prostatic hyperplasia, an effect correlated with reduced serum estradiol concentrations and prostate alveolar morphology.
Conclusions: Evaluation was conducted of the efficacy of the Ginkgo biloba L. extract, and its anti-proliferative and estrogenic activity was shown in a model of benign prostatic hyperplasia.

Key words: Ginkgo biloba L., benign prostatic hyperplasia, prevention, phytomedicine.

INTRODUCCIÓN

La hiperplasia prostática benigna (HPB) es el crecimiento no canceroso de la glándula prostática causado por un aumento de la proliferación del epitelio glandular. La frecuencia de este padecimiento aumenta progresivamente a partir de los 40 años de edad, es considerada una de las enfermedades benignas más comunes en el hombre y puede ocasionar síntomas del tracto urinario inferior (STUI).¹ Las causas de este padecimiento son multifactoriales;² sin embargo, Gonzales y otros reportaron que la presencia de los andrógenos es fundamental para su desarrollo,³ por eso los principales tratamiento se basan en el uso de fármacos antiandrogénicos como la finasterida.⁴ No obstante, Cote y otros demostraron que estos medicamentos, a pesar de disminuir el volumen prostático, no disminuyen los niveles de expresión del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), marcador empleado comúnmente para evaluar la proliferación celular en las muestras de tejidos sanos y malignos.^5,6 Además, estos fármacos ocasionan efectos adversos a largo plazo, tales como disfunción eréctil e impotencia sexual.⁷ Por otro lado, el uso de Ginkgo biloba L. (G. biloba), fitomedicamento empleado en la medicina tradicional para prevenir el alzhéimer y mejorar la agudeza mental,⁸ha demostrado tener efecto estrogénico y antiproliferativo en diversos modelos de cáncer como el cáncer de mama, hepático y colorrectal, por lo que se prescribe como una opción para el tratamiento de esta enfermedad.^6,9-12En relación con la próstata, Biggs y otros demostraron que el extracto estandarizado obtenido a partir de esta planta fue capaz de disminuir el riesgo de padecer cáncer de próstata.¹³

El objetivo del presente trabajo fue evaluar la eficacia del extracto de Ginkgo biloba L EGb en un modelo de hiperplasia inducido por la administración de propionato de testosterona (PT).

MÉTODOS

Animales

Se utilizaron ratas macho adultas de la línea Wistar (250-300 g de peso corporal) las cuales se mantuvieron en condiciones estándar de laboratorio dos semanas previas al inicio de los experimentos con acceso a agua y alimento ad libitum en un ciclo luz-oscuridad invertido (12 h). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la NOM-062-ZOO-1999 en su apartado "Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio".¹⁴

Extracto de G. biloba (EGb)

El EGb (VASODIL^®) es un extracto natural obtenido de las hojas verdes desecadas del árbol G. biloba. Cada mililitro contiene 40 mg de extracto seco de G. biloba estandarizado a 9,6 mg de glucósidos flavonoides, calculados como quercetina y camferol. Se fabrica en México con licencia del Dr. Wilmar Schwabe por la firma Nycomed S.A. de C.V.^®. Número de registro del medicamento: 178M89 SSA IV. Clave de IPPA: LPAR-07330022040176/RM2007.

Procedimiento experimental: inducción de la hiperplasia prostática benigna (HPB)

Se indujo la HPB mediante la administración subcutánea de propionato de testosterona (PT) ([TestoVet®], 3 mg/kg^-1). Después de una semana de administración, las ratas fueron distribuidas en siete grupos (n= 6) con los siguientes tratamientos: 1) el grupo control (CTRL) recibió agua estéril (v.o., 10 U) y aceite mineral (s.c., 10 U); 2) el grupo experimental (HPB) recibió agua estéril (v.o., 10 U) y PT (s.c.); 3) el grupo control positivo (FT) recibió finasterida [MediMart] 10 mg/kg^-1 (v.o.) y PT (s.c.); 4-7) los grupos experimentales tratados (EGb) recibieron EGb ([Vasodil] en dosis de 40, 80, 160 y 320 mg/kg^-1/día [v.o.] y PT [s.c.], respectivamente).⁶Los tratamientos se administraron una vez al día durante 1 mes y las ratas se pesaron semanalmente. Todos los animales se mantuvieron en ayunas durante 24 h y fueron eutanizados con pentobarbital sódico al 6,3 % ([Pisabental], 50 mg/kg^-1, i.p.). Se extrajo sangre por punción cardiaca, se separó el suero, el cual se mantuvo a -20 °C para el posterior análisis de los niveles de estradiol (E), y la próstata, la cual se pesó y dividió en sus lóbulos ventral (PV) y dorsolateral (PDL). El peso prostático relativo fue estimado mediante la proporción del peso de la próstata en relación con el peso corporal. Cada lóbulo se separó en dos secciones, la parte derecha se fijó utilizando formalina al 10 % e incluyó en parafina. Se realizaron cortes de 5 µm de grosor con un micrótomo (A202, Ecoshel) y se montaron en portaobjetos. Los cortes se tiñeron utilizando la técnica de Hematoxilina y Eosina (H & E), se observaron al microscopio, se tomaron tres fotografías por cada laminilla con ayuda de una cámara digital (Sony Ciber-Shot, 10MP). Se utilizó el objetivo de 4X (Zoom 2X). La parte izquierda fue almacenada a -80 °C para analizar la expresión del PCNA.

Cuantificación de las proteínas y de la expresión del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA)

El tejido fue homogeneizado con 200 µL de amortiguador de lisis RIPA (TRIS 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA disódico 1 mM, SDS 0,1 %, deoxicolato de sodio 0,5 % y NP-40 0,5 %, y PMSF 1 %) previa pulverización en un mortero de las muestras congeladas en nitrógeno líquido. El homogenizado se incubó por 10 min a 4 °C y se centrifugó a 6 000 r.p.m. durante 30 min a 4 °C. La concentración de proteínas en el sobrenadante se determinó por el método de Bradford. Se desnaturalizaron cantidades iguales de muestra, correspondientes a 50 µg de proteínas totales a 95 °C durante 5 min en baño María, se corrieron a 100 V en un gel de poliacrilamida con SDS al 4 % en condiciones reductoras (Mini-Protean III, Bio-Rad) y después fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa (0,45 µm, 162-0115 Bio-Rad) en el equipo Mini-Protean III, Bio-Rad durante 1,5 h y 100 V, la cual fue bloqueada con TBS (Tween 20 al 0,1 % y leche descremada al 5 %) por espacio de 1 h. A continuación, la membrana se lavó con solución de TBS-Tween 20 durante 5 min y se incubó toda la noche a 4 °C con el anticuerpo antiantígeno de proliferación celular (PCNA; F-2 sc-25280, Santa Cruz CA, EUA, dilución 1:500). Transcurridas 24 h, la membrana se lavó con TBS-Tween y se incubó con el anticuerpo secundario por 1 h a temperatura ambiente (PI-2000, Vector CTR, dil.1:1000). Las bandas se revelaron empleando un kit quimioluminiscente (Lumigol). Como control de carga se utilizó actina (C-11 sc-1615, Santa Cruz CA, USA, dilución 1:1000).^15,16

Análisis densitométrico

Se midió la quimioluminiscencia en un fotodocumentador (SynGene) y se analizó posteriormente con el uso del software Image J. Los valores de las densidades obtenidas de las bandas de PCNA se dividieron entre las densidades de las bandas de actina para obtener la densidad relativa de cada grupo. Dichos resultados fueron graficados y analizados estadísticamente.¹⁶

Determinación de las concentraciones de estradiol (E)

Para determinar las concentraciones séricas de E se utilizó un kit comercial (ES180S-100, Calbiotech).¹⁷ Del suero almacenado, así como de los reactivos del kit comercial (estándar y control), se colocaron 25 µL en cada pozo de la microplaca previamente recubierta con un anticuerpo policlonal anti-estradiol. Inmediatamente después, se adicionaron 100 µL de reactivo de trabajo, se agitó la placa de 15 a 20 s y se incubó durante 2 h a temperatura ambiente, se decantó y se cubrió con 100 µL de sustancia amortiguadora de lavado. Se dejó secar y se adicionaron 100 µL de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) en cada pozo, se agitó por espacio de 10 s y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Posteriormente se adicionaron 50 µL de solución de parada y se mezcló durante 30 s, se observó un cambio de color de azul a amarillo. La lectura de absorbancias a 450 nm se realizó en un lector de microplacas (iMARK^TM, Biorad). La concentración de E en cada muestra (pg/mL) se determinó mediante regresión lineal en una hoja de cálculo de Microsoft Excel.

Análisis estadístico

Los datos de cada parámetro se sometieron a un diseño de tratamientos sin estructura. Una vez comprobados los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas, las diferencias estadísticas se determinaron mediante un análisis de varianza (ANOVA). Cuando el análisis mostró diferencias significativas entre los grupos, los datos se analizaron empleando la comparación de medias Fisher LSD. La significancia estadística se consideró cuando p< 0,05 y p< 0,01.

RESULTADOS

Peso en fresco y expresión del PCNA en la próstata dorsolateral (PDL)

La administración de PT durante un periodo de 5 semanas causó el incremento significativo del peso en fresco de la PDL en el grupo HPB al compararlo con el grupo control, el cual recibió solamente agua estéril y aceite mineral (p< 0,01), el mismo efecto que se observó en el grupo tratado con PT y EGb en la dosis de 40 (p= 0,012), 80 (p< 0,01) y 320 mg/kg^-1 (p< 0,01). En los grupos tratados con PT y con finasterida no se observaron diferencias en relación con el grupo control, al igual que en el grupo tratado con EGb en una concentración de 160 mg/kg^-1(Fig. 1A). Del mismo modo, el análisis de la expresión de PCNA en la PDL mostró un aumento significativo en el grupo tratado con PT (p= 0,032) y con EGb en concentración de 320 mg/kg^-1(p= 0,048), no se observó este incremento en los grupos tratados con finasterida y EGb en dosis de 40, 80 y 160 mg/kg^-1(Fig. 1B). Este efecto se puede corroborar con la observación de la muestra histológica, la cual confirma un incremento evidente en el perímetro alveolar de los tejidos cuando se administran PT y EGb en dosis de 320 mg/kg^-1, mientras que en los tejidos de los grupos control y de los tratados con finasterida y EGb en dosis de 40 a 160 mg/kg^-1 se muestra un perímetro alveolar menor (Fig. 2).

Peso en fresco y expresión del PCNA en la próstata ventral (PV)

La administración de PT durante 5 semanas mostró el incremento significativo del peso en fresco en los grupos HPB (p= 0,01) y en aquellos tratados con EGb en dosis de 40 (p< 0,01), 80 (p< 0,01), 160 (p= 0,014) y 320 mg/kg^-1(p< 0,01) en relación con el grupo control. Este efecto no se observó en el grupo tratado con PT y finasterida (Fig. 3A). Lo anterior se relaciona con la expresión del PCNA. No se observaron diferencias significativas entre los diferentes grupos (F= 0,587, p= 0,739) (Fig. 3B). El análisis histológico revela que solo en el grupo tratado con PT y finasterida se puede observar un perímetro alveolar similar al observado en el grupo control (Fig. 4).

Concentraciones de estradiol (E) en el suero

Con el objetivo de poder elucidar el efecto estrogénico del EGb empleado en este modelo, se determinaron los niveles de E en los diferentes grupos experimentales y se observó una disminución significativa al comparar los grupos tratados con EGb en dosis de 40 y 160 mg/kg ^-1(p< 0,01) en relación con el grupo tratado con PT (F= 2,991, p= 0,011), efecto similar al que se observa con la administración de finasterida (p= 0,016) sin observarse esta disminución con la concentración de 320 mg/kg^-1 (Fig. 5)

DISCUSIÓN

El EGb es un conocido fitomedicamento obtenido de la especie G. biloba, planta que ha sido utilizada durante miles de años para tratar y prevenir diferentes enfermedades, entre ellas el cáncer.Aunque está formado por una mezcla de más de 300 compuestos, los glucósidos flavonoides, principalmente camferol y quercetina, se piensa que son responsables del potencial fitoestrogénico atribuido a G. biloba.¹⁸ Además, estudios previos han demostrado que puede ser empleado como agente quimiopreventivo eficaz debido a sus propiedades antiproliferativas y apoptóticas reportadas en varios modelos in vitro de cáncer.¹²

En este trabajo se evaluó el efecto de un extracto comercial de G. biloba (EGb) sobre el peso en fresco y la expresión del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) en un modelo de hiperplasia prostática benigna, inducida mediante la administración de propionato de testosterona (PT) en ratas macho de la línea Wistar.⁶ Con el objetivo de poder elucidar su actividad estrogénica, también se analizaron las concentraciones séricas de estadiol en la sangre obtenida por punción cardiaca, una vez concluido el periodo de tratamiento. En los resultados se observó que, en comparación con el grupo control, en los sujetos que solo recibieron PT hubo un aumento considerable del peso en fresco de la próstata dorsolateral (PDL). Este aumento no se observó en la próstata de sujetos que recibieron, además, finasterida y EGb en concentración de 160 mg/kg^-1. Es interesante notar que esta disminución no se observó en la próstata ventral (PV). Además, el análisis densitométrico de la relación de PCNA/actina en la PDL mostró que la expresión del PCNA disminuyó notablemente en los grupos tratados con EGb en concentraciones de 40, 80 y 160 mg/kg^-1 sin observarse cambios en la PV.

Para inducir la hiperplasia prostática benigna (HPB) se administraron 3 mg/kg^-1 de PT, dosis establecida como modelo para provocar la hiperplasia, que evoluciona con incremento de la proliferación epitelial-estromal y aumento de la expresión del PCNA.^6,19 En este estudio se mostró que unido a la disminución del volumen prostático, en los sujetos tratados con EGb disminuyó la proliferación celular a partir de la dosis de 40 mg/kg^-1 y se observó la mayor reducción en dosis de 160 mg/kg^-1, lo que indica un efecto dependiente de la dosis.^20,21 Lo anterior coincide con lo reportado por Birks y otros, quienes mostraron que dosis menores que 200 mg/kg^-1son seguras para mejorar las funciones neurales relacionadas con la cognición y el aprendizaje,²² y las dosis efectivas son las que van de 40 a 240 mg/kg^-1.²³ Lo anterior indica que la dosis de 160 mg/kg^-1 fue segura y efectiva para disminuir tanto el peso en fresco como la expresión del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) en la próstata dorsolateral, y no se observó efecto con la dosis de 320 mg/kg^-1, probablemente debido a una saturación de los sitios de acción de los fitocomponentes del EGb, lo cual corrobora que el EGb empleado en este estudio es efectivo en las dosis previamente mencionadas.^22-24

De los mecanismos propuestos según los cuales el EGb disminuye la proliferación celular, Peng y otros plantean que podría deberse a su actividad fitoestrogénica.²⁵ Al analizar las concentraciones séricas de estradiol se observó una disminución significativa en los grupos tratados con EGb en relación con el grupo tratado con PT, efecto que podría estar indicando una disminución de la actividad de la enzima aromatasa, responsable de la conversión de testosterona (T) a estradiol (E), lo cual ocasiona la disminución de la proliferación celular prostática observada. En este sentido, se conoce que el estadiol influye en la proliferación de células del estroma mediante un aumento en la expresión de receptores a estrógenos tipos alfa (RE α) involucrados en el crecimiento prostático, por lo que la disminución de los valores de estradiol podría estar generando un antagonismo de la expresión del RE α y, por ende, una disminución de la proliferación celular.^18,26Esto concuerda con lo reportado previamente por Härkönen y Mäkelä, quienes demostraron que los estrógenos afectan tanto el crecimiento como la diferenciación prostática, lo que indica que el posible mecanismo de acción del EGb es antagónico sobre los receptores RE α,²⁷ efecto que sería interesante analizar.

Estudios realizados por Zhang y otros muestran que el EGb inhibe la incorporación de timidina al ADN y, por ende, su biosíntesis. Este efecto podría deberse a que el EGb provoca la inhibición de las quinasas involucradas en la fosforilación de los nucléotidos de timidina e impide de esta forma el crecimiento celular.²⁸ Asimismo, se ha demostrado que puede interferir en el ciclo celular al inhibir la progresión de la fase G0 a la fase S, y así reduce la síntesis de ADN y, por consiguiente, la mitosis en las líneas celulares de cáncer.²⁰ Por otro lado, se ha evidenciado que el EGb tiene actividad apoptótica al inhibir la expresión de genes de supervivencia como BCl-2 y BCl-xL,²⁹ de tal forma que estos mecanismos podrían explicar la disminución de la proliferación celular observada en los sujetos con HPB tratados con EGb.

Una posible causa por la cual no se observó el mismo efecto en la próstata ventral (PV) puede ser la menor sensibilidad a los andrógenos que presenta este lóbulo con respecto a la próstata dorsolateral (PDL), ya que las concentraciones del receptor de andrógeno (RA) disminuyen en la PV en función de la edad, además contiene un menor porcentaje de células positivas para el PCNA,³⁰ proteína cuya expresión puede ser regulada por los andrógenos,³¹ lo que ocasiona un efecto poco importante del EGb sobre la PV. Esto último se corroboró en el peso en fresco, donde se observó un aumento considerable a partir de la dosis de 40 mg kg^-1. En estas condiciones, las concentraciones de dihidrotestosterona (DHT; principal metabolito activo de la testosterona) podrían ser muy elevados, ya que McPherson y otros, evidenciaron que los niveles de DHT aumentaban conforme aumentaba el peso en fresco de la próstata.³² Por eso, sería interesante poder determinar las concentraciones de testosterona y DHT en el tejido de ambos lóbulos tratados con el EGb.

Al comparar los niveles de expresión del PCNA en el grupo tratado con finasterida, se muestra que a pesar de que hubo una disminución del peso en fresco en ambos lóbulos, no se observó una disminución importante de los niveles del PCNA, lo cual indica que la finasterida no disminuye la proliferación celular, pero sí produce una disminución del volumen prostático, razón por la cual es capaz de disminuir los síntomas del tracto urinario inferior.⁵

Los resultados de este estudio demostraron que el extracto de G. biloba tiene actividad antiproliferativa en la próstata evidenciada por la disminución tanto del peso en fresco de la glándula como de la expresión del PCNA en la PDL (zona homóloga a la zona de transición de la próstata en humanos y donde se produce la hiperplasia prostática benigna) de ratas macho de la línea Wistar con la administración de propionato de testosterona en las dosis efectivas previamente reportadas. La disminución de las concentraciones de estadiol en el suero de las ratas de los grupos tratados con EGb demuestra que los efectos en el peso en fresco y en la estructura histológica podrían estar relacionados con una actividad antiproliferativa causada por el efecto fitoestrogénico antagónico sobre los receptores RE α.¹⁸ Por tanto, se pudo determinar la eficacia del EGb y demostrar su actividad antiproliferativa y estrogénica en un modelo de hiperplasia prostática benigna.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue apoyado por el Programa de Mejoramiento del Profesorado (PROMEP)-Universidad Veracruzana-PTC (103.5/13/7135) y por UV-CA-202 "Química Biomolecular".

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

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Recibido: 3 de noviembre de 2016.
Aprobado: 4 de marzo de 2017.

Luz Irene Pascual Mathey. Facultad de Química Farmacéutica Biológica, Universidad Veracruzana, Xalapa. Veracruz, México.
Correo electrónico: lupascual@uv.mx