Determinación de la actividad antioxidante de Malvaviscus arboreus Cav. (Malvavisco)

Laura María Arroyave Murillo; Milton Gómez Barrera; Luis Hernando Hurtado Tobón

Determinación de la actividad antioxidante de Malvaviscus arboreus Cav. (malvavisco)

ARTÍCULO ORIGINAL

Determinación de la actividad antioxidante de Malvaviscus arboreus Cav. (malvavisco)

Determination of antioxidant activity of Malvaviscus arboreus Cav. (Malvavisco)

Laura María Arroyave Murillo*
Milton Gómez Barrera
Luis Hernando Hurtado Tobón

Universidad del Quindío, Armenia. Colombia.

RESUMEN

Introducción: Malvaviscus arboreus Cav., especie perteneciente a la familia Malvaceae, es reconocida en la cultura popular de algunos países por sus beneficios para pacientes con enfermedades nerviosas, respiratorias o estomacales.
Objetivos: Determinar en las partes aéreas de la especie M. arboreus los metabolitos secundarios a los cuales se les atribuye acción farmacológica, y evaluar sus propiedades antioxidantes y su efecto citotóxico.
Métodos: Se recolectó el material vegetal, se secó y, por último, se molió para su posterior percolación con etanol al 95 %. A los extractos enteros de las flores y las hojas se les realizó el tamizaje fitoquímico y el fraccionamiento por cromatografía de columna, las fracciones obtenidas se revelaron con reactivos de identificación. La primera fracción obtenida de la columna de flores con metanol (MF1) fue analizada mediante cromatografía líquida de alta eficacia con detector de arreglo de diodos (HPLC-PAD por sus siglas en inglés) y cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (GC-MS por sus siglas en inglés). Se evaluó la capacidad antioxidante de los extractos mediante el método de autoxidación del pirogalol y se realizó el ensayo de citotoxicidad en Artemia salina.
Resultados: Los extractos de las flores y las hojas de la especie M. arboreus poseen metabolitos secundarios como alcaloides, flavonoides, taninos, naftoquinonas o antraquinonas, glucósidos cardiotónicos y lactonas terpénicas. En la columna de flores con metanol se detectó la presencia de dos compuestos: 2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-4H-pyran-4-ona y DL-prolina-5-oxometil éster. La actividad antioxidante muestra un porcentaje de inhibición de 20 % para las flores y de 43 % para las hojas. La prueba de citotoxicidad en Artemia salina arrojó valores de 1 598 µg/mL (flores) y 628 µg/mL (hojas).
Conclusiones: Se demuestra la existencia de metabolitos de alto interés farmacológico, fundamentalmente alcaloides y flavonoides, los cuales pueden ser los responsables de la acción farmacológica que se le atribuye a la planta. Los dos compuestos detectados, 2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-4H-pyran-4-ona y DL-Prolina-5-oxometil éster, posibles agentes antimutágenos, antitumorales y anticancerígenos, hacen de M. arboreus una especie promisoria para la fabricación de nuevos medicamentos para tratar el cáncer, las neoplasias y los tumores, entre otras enfermedades.

Palabras clave: Malvaviscus arboreus; cromatografía; actividad antioxidante; pirogalol; citotoxicidad.

ABSTRACT

Introduction: Malvaviscus arboreus Cav., a species from the family Malvaceae, is well known in the folk culture of some countries for its use to treat nervous, respiratory and digestive disorders.
Objectives: Determine the secondary metabolites present in the aerial parts of M. arboreus, which are attributed pharmacological activity, and evaluate their antioxidant properties and cytotoxic effects.
Methods: Plant material was collected, dried and ground for its eventual percolation with 95 % ethanol. The whole flower and leaf extracts underwent phytochemical screening and column chromatography fractionation, and the fractions obtained were revealed with identification reagents. The first fraction obtained from the flower column with methanol (MF1) was analyzed by high performance liquid chromatography with photodiode array (HPLC-PDA) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Antioxidant activity of the extracts was evaluated with the pyrogallol autoxidation method, and the cytotoxicity test was performed on Artemia salina.
Results: The extracts from M. arboreus flowers and leaves were shown to contain secondary metabolites such as alkaloids, flavonoids, tannins, naphthoquinones or anthraquinones, cardiac glycosides and terpene lactones. MF1 detected the presence of two compounds: 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H -pyran-4-one and Dl-proline-5-oxo-methyl ester. Inhibition percentage of the antioxidant activity is 20 % for flowers and 43 % for leaves. Cytotoxicity analysis of Artemia salina revealed values of 1 598 µg/mL for flowers and 628 µg/mL for leaves.
Conclusions: Evidence was found of the presence of metabolites of high pharmacological interest, mainly alkaloids and flavonoids, which may be responsible for the pharmacological action attributed to the plant. The two compounds detected, 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6 -methyl-4H-pyran-4-one and Dl- proline-5-oxo-methyl ester, potential anti-mutagenic, anti-tumor and anti-cancer agents, make M. arboreus a promising species for the manufacture of new drugs to treat cancer, neoplasms and tumors, among other diseases.

Key words: Malvaviscus arboreus; chromatography; antioxidant activity; pyrogallol; cytotoxicity.

INTRODUCCIÓN

Una parte importante de la flora del mundo se localiza en Latinoamérica, en particular en Colombia, uno de los países con mayor biodiversidad¹según la Organización para la Educación y Protección Ambiental (OpEPA).

Malvaviscus arboreus Cav (sin: falso hibisco, malvavisco, san Joaquín, manzanita, farolito en México y pasiflora en Cuba) es una de las muchas especies que crecen en Colombia. De esta planta no se ha encontrado información farmacológica que confirme su efectividad ni ningún estudio toxicológico que evidencie seguridad para su uso. A pesar de esto, y de la escasa información sobre su utilización tradicional como sedante, es de gran interés empezar a estudiar esta especie porque se ha demostrado que las plantas que poseen mucílagos son relajantes, suavizan y ablandan las partes inflamadas, además de que actúan directamente sobre el sistema nervioso.²

Entre las aplicaciones etnomédicas de las diferentes variedades de esta especie, en otros países de Centroamérica se usa como antitusivo, anticatarral, para tratar enfermedades renales,³ para prevenir el aborto y las complicaciones antes y después del parto.^4,5Hasta ahora solo se reportan sus actividades farmacológicas probadas como antiinflamatorio,⁶antibacteriano y antifúngico.⁷

Esta investigación tiene como objetivo determinar en las partes aéreas de la especie M. arboreus los metabolitos secundarios a los cuales se les atribuye acción farmacológica, y evaluar sus propiedades antioxidantes y su efecto citotóxico.

MÉTODOS

Recolección del material vegetal

El material vegetal se recolectó en el sur de la ciudad de Armenia (Colombia) ubicada a una altura aproximada de 1 460 metros sobre el nivel del mar en horas de la mañana. Se seleccionaron flores y hojas sanas sin contaminación de insectos, sin quemaduras y sin ningún otro daño.

Clasificación taxonómica y secado del material vegetal

El material vegetal recolectado se llevó al Herbario de la Universidad del Quindío. Allí se hizo la adecuada clasificación taxonómica y se catalogó como Malvaviscus arboreus Cav perteneciente a la familia Malvaceae. Se ingresó con el código HUQ: 37425 y con el código de barras 14647. Las flores y las hojas de la planta se secaron por separado a 40 °C en una estufa de aire circulante marca GALLENKAMP durante 15 días.

Obtención y fraccionamiento de los extractos de la especie M. arboreus

Los extractos de las flores y las hojas de M. arboreus se obtuvieron por percolación con etanol al 97 % a partir de 230 g de flores y 510 g de hojas (material secado y molido previamente). A los extractos enteros obtenidos se lesrealizó el tamizaje fitoquímico preliminar,⁸se fraccionaron por cromatografía en columna (CC) utilizando 3,6845 g del extracto de flores y 8,8788 g del extracto de hojas. Se usó como fase estacionaria gel de sílice 60 (0,062-0,2 mm) y como fase móvil se emplearon solventes de diferente polaridad en orden ascendente como lo indica la serie eluotrópica, se comenzó con cloroformo, se continuó con acetato de etilo y se concluyó con metanol. Las fracciones obtenidas se sembraron en placas de cromatografía en capa delgada (CCD) y se revelaron con los reactivos de identificación para cada metabolito.⁹

Análisis mediante HPLC-PAD y GC-MS de la fracción MF1

La primera fracción de metanol obtenida del extracto de flores (MF1) se analizó mediante cromatografía líquida de alta eficacia con detector de arreglo de diodos (HPLC-PAD) en un equipo marca Thermo Dionex modelo Ultimate 3000 acoplado a un detector DAD, columna de octadecilsilano (C18), flujo de 1 mL/min durante 30 min por cada fracción y con paso de solventes en gradiente de polaridad ascendente; inicialmente con 100 % de acetonitrilo, luego con 100 % de metanol y para finalizar con una mezcla de 50 % de metanol y 50 % de agua. El análisis por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (GC-MS) se realizó con un cromatógrafo de gases marca SHIMADZU modelo QP2010 ULTRA con una columna DB5 de 29 metros de longitud, 0,25 μm de diámetro interior y 0,25 μm de grosor de la película, acoplado a un espectrómetro de masas marca SHIMADZU con un detector de masas por impacto electrónico 70 eV. La fase móvil utilizada fue helio con flujo de 1 mL/min a una presión de 77,8 kPa y temperatura inicial de 70 °C y final de 300 °C, velocidad de calentamiento 6 °C/min, Split 10 y modo SCAN 40-500 unidades de masa atómica.

Actividad antioxidante de los extractos enteros de las flores y las hojas de la especie M. arboreus

La actividad antioxidante se evaluó mediante el método de generación del radical superóxido por autoxidación del pirogalol.¹⁰ Se utilizaron como reactivos pirogalol ACS, Reag. tris-hidroximetilaminometano ACS, Reag. DTPA (ácido dietilentriaminpentaacético) y HCl.

Las soluciones de la muestra problema se prepararon en solución tampón de tris-hidroximetilaminometano (50 mM con pH 8,2) y el extracto se diluyó previamente en dimetilsulfóxido (DMSO). Se midió la absorción de las muestras a 420 nm en un espectrofotómetro UV-Vis marca Thermo Fisher Scientific modelo Evolution 201 a temperatura ambiente de 24 °C. Se midió el blanco, el cual contenía 765 μL de solución de TRIS-tampón con 10 μL de pirogalol durante 5 min a intervalos de 2 seg. Inmediatamente se procedió a medir las muestras que contenían la misma mezcla del blanco con adición de 25 μL de los extractos a analizar en las mismas condiciones anteriores (cada extracto por separado).

Determinación de la concentración letal media

Se determinó la concentración letal media (CL₅₀) mediante un bioensayo de citotoxicidad. Los crustáceos de Artemia salina se expusieron a concentraciones decrecientes de los extractos etanólicos de las flores y las hojas de la especie Malvaviscus arboreus y se evaluó su mortalidad a las 24 h.

Análisis estadístico

Se determinó la CL50 mediante el análisis cuantal Probit con el programa Statgraphics Centurion XV.

Para evaluar la capacidad antioxidante de los extractos se utilizó la técnica estadística de comparación de líneas de regresión con la cual cada línea de regresión modela la forma en que varía la absorción (variable dependiente) a través del tiempo (variable independiente) a intervalos de 2 seg durante 5 min.

Se analizó entonces el siguiente conjunto de ecuaciones:

W= a1+b1X+Ԑ1 (Ecuación blanco)

Y= a2+b2X+Ԑ2 (Ecuación flores)

Z= a3+b3X+Ԑ3 (Ecuación hojas)

Con la información que se obtuvo del experimento se probó el siguiente sistema de hipótesis:

Sistemas de hipótesis para las flores

Primer sistema de hipótesis	Segundo sistema de hipótesis
H_o: a=0 ó a₂-a₁ = 0	H_o: b=0 ó b₂-b₁ = 0
H₁: a≠0 ó a₂-a₁ ≠ 0	H₁: b≠0 ó b₂-b₁ ≠ 0

Sistemas de hipótesis para las hojas

Primer sistema de hipótesis	Segundo sistema de hipótesis
H_o: a=0 ó a₃-a₁ = 0	H_o: b=0 ó b₃-b₁ = 0
H₁: a≠0 ó a₃-a₁ ≠ 0	H₁: b≠0 ó b₃-b₁ ≠ 0

El estadístico de prueba para ambos casos se apoyó en la distribución t de Student y los cálculos de la capacidad antioxidante se realizaron con el programa Statgraphics Centurion XV.

RESULTADOS

Se obtuvieron por percolación los extractos de las flores y las hojas de la especie en una cantidad de 85,7625 g para las flores y 136,4895 g para las hojas. Se realizó el tamizaje fitoquímico de estos extractos. Los resultados más relevantes mostraron abundancia de alcaloides solubles en HCl y cloroformo, alcaloides de amonio cuaternario u óxidos de amina en las hojas, y alcaloides solubles en HCl al 5 % y alcaloides de amonio cuaternario u óxidos de amina en las flores, además de flavonoides.

En las fracciones obtenidas por cromatografía den capa delgada que fueron reveladas con los reactivos de identificación, se evidenció la presencia de alcaloides mayormente en las fracciones clorofórmicas de ambos extractos; los fenilpropanos, flavonoides, fenoles y alcoholes superiores se encontraron en mayor proporción en las fracciones de acetato de etilo y metanol con coloraciones más marcadas para las fracciones obtenidas del extracto de las flores.

Se detectó la presencia de aceites esenciales, esteroides, esteroles, diterpenos y terpenoides en las fracciones de todas las polaridades. Se observaron sapogeninas esteroidales, cumarinas, antronas y antraquinonas en todas las fracciones, mayoritariamente en las fracciones obtenidas del extracto de flores.

El análisis de detección cualitativa mediante HPLC-PAD de la fracción metanólica obtenida de las flores de la especie M. arboreus MF1 mostró varios compuestos con absorciones y tiempos de retención no reportados con anterioridad para la especie.

El cromatograma obtenido, los máximos de absorción y los tiempos de retención se muestran en la figura 1.

El análisis realizado a la fracción MF1 mediante GC-MS muestra la presencia de dos compuestos cuyos tiempos de retención y porcentajes de abundancia se pueden observar en el cromatograma de la figura 2.

Estos resultados se compararon con la biblioteca NIST del equipo la cual mostró los espectros de masas que más se asemejan a cada compuesto y que se pueden observar en la figura 3.

Actividad antioxidante de los extractos enteros de las flores y las hojas de M. arboreus

Actividad antioxidante del extracto de las flores

El resultado de la regresión para el primer sistema de hipótesis muestra que hay diferencia significativa entre los interceptos de las líneas de regresión de las absorciones de las flores y del blanco (se rechaza la hipótesis nula con valor de p= 0,00001). Esta diferencia se debe a que la absorción en la muestra de flores es mayor debido a la coloración del extracto.

El segundo sistema de hipótesis muestra que no hay diferencia significativa entre las pendientes de las flores y del blanco (se acepta la hipótesis nula con valor de p= 0,7002), es decir, que ambas pendientes tienen el mismo ritmo de crecimiento.

Actividad antioxidante del extracto de las hojas

El análisis de las hojas, al igual que el de las flores, muestra diferencia significativa entre los interceptos de las líneas de regresión de las absorciones con la debida coloración de la muestra (se rechaza la hipótesis nula con valor de p= 0,00001). El segundo sistema de hipótesis muestra que hay diferencia significativa entre las pendientes de las hojas y el blanco (se rechaza la hipótesis nula con valor de p= 0,0001). El valor negativo de la pendiente indica que el aumento de la absorción del extracto de las hojas es más lento que el de la absorción del blanco.

La expresión de los resultados se reporta como porcentaje de inhibición de la autoxidación del pirogalol respecto a la reacción control (blanco) según la siguiente ecuación:

donde

C: reacción control (promedio de absorbancias)

P: reacción con el compuesto problema (promedio de absorbancias)

Los resultados se muestran en la tabla 1.

El signo negativo que aparece en el porcentaje de inhibición de cada uno de los extractos se debe a que la absorción con el compuesto problema es mayor que la absorción con el blanco debido a la coloración de la muestra (extracto de las flores y las hojas).

Determinación de la concentración letal media CL50

La prueba de citotoxicidad de los extractos de las flores y las hojas de la especie M. arboreus se realizó con huevecillos de Artemia salina, los cuales se incubaron en una solución de sal marina al 3,5 % a temperatura ambiente y en un lugar con suficiente iluminación. La eclosión de los nauplios se produjo a las 24 h de incubación.

Para preparar las soluciones se pesaron 25 mg de cada extracto y se aforaron en balones de 25 mL con sal marina al 3,5 %. A partir de esta solución madre se prepararon soluciones en concentraciones de 750, 500, 250, 100, 50 y 25 μg/mL. Se colocaron en viales con 5 mL de cada solución y con 20 nauplios cada uno. El experimento se realizó tres veces con cada una de las concentraciones.

La lectura de los nauplios muertos se realizó a las 24 h después de la siembra y el análisis estadístico de los datos para determinar la CL50 se realizó con una regresión tipo Probit con el programa Statgraphics.

Los datos que arrojó esta técnica muestran valores de 1 598 μg/mL para el extracto de las flores y de 628 μg/mL para el extracto de las hojas, aproximadamente. Dichos datos se obtuvieron con intervalos de confianza del 95 %.

Estos valores se compararon con la clasificación de toxicidad del Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED).¹⁰ Los resultados de la mortalidad de los nauplios en cada concentración se muestran en la tabla 2.

DISCUSIÓN

Mediante el tamizaje fitoquímico y el revelado cromatográfico se observan metabolitos de alto interés farmacológico, fundamentalmente alcaloides y flavonoides, los cuales pueden ser responsables de la acción sedante y antiinflamatoria que, según la creencia popular, tiene esta planta.

El compuesto identificado como 2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-4H-pyran-4-ona, más conocido como DDMP, es un compuesto intermedio obtenido a partir de D-glucosa, hexosa, dextrosa y maltosa y del hongo Pycnoporus sanguineus. A este compuesto se le reconocen diferentes actividades biológicas tales como actividad anti-alfa glucosidasa, antimutágena y antitumoral. El compuesto DDMP pertenece al grupo de flavonoides, flavonas y flavonoles a los cuales se les ha comprobado actividad antimicrobiana, antioxidante y antiinflamatoria, principalmente.¹¹

Esta detección confirma los resultados para los flavonoides en el tamizaje fitoquímico mediante la prueba de Shinoda y los resultados con los reactivos de aspersión.

En cuanto al cromatograma obtenido por HPLC-PAD, los picos de absorción que se muestran son similares a los máximos de absorción característicos de los flavonoides, y van de 300 a 390 nm para la funcionalidad cinamoílo y de 250 a 280 nm para la funcionalidad benzoilo.¹² Los tiempos de retención de algunos flavonoides estudiados están entre los 20 y 30 min aproximadamente;¹³ en este caso, los flavonoides aparecen entre los 4 y 6 min. Esto se debe a que el tiempo de retención de cada compuesto depende directamente del tamaño de la molécula, esta es la razón por la cual dichos tiempos de retención aparecen en períodos más cortos que los de los flavonoides.

En cuanto al segundo compuesto identificado mediante GC-MS, DL-prolina-5-oxo-metil éster. Se sabe que se ha identificado en la especie Euphorbia kansui de la familia Euphorbiaceae que es muy utilizada en la medicina china tradicional para el tratamiento de diferentes enfermedades.

Estudios realizados anteriormente con el extracto de E. kansui han demostrado que posee efectos antitumorales sobre las células neoplásicas, inhibe su proliferación y estimula la diferenciación en múltiples líneas celulares de cáncer como el cáncer no microcrítico de pulmón, cáncer de colon, melanoma y cáncer renal. El estudio en cuestión demuestra que los derivados de éster metílicos, identificados en E. kunsui, incluyendo DL-prolina-5-oxo-metil éster, tienen actividad antitumoral potente y muestran citotoxicidad en el programa de cribado del cáncer humano.¹⁴

Este es un resultado más que confirma los anteriores a los que se llegó mediante el tamizaje fitoquímico y las pruebas de aspersión para los alcaloides, ya que el compuesto presenta un nitrógeno en su estructura.

La actividad antioxidante de los extractos de flores y hojas de M. arboreus muestra que, según el análisis de las líneas de regresión y los porcentajes obtenidos, la capacidad antioxidante del extracto de flores es de 20 % y la del extracto de hojas, de 43 % aproximadamente; esto se debe a la presencia de compuestos polifenólicos detectados en ambos extractos.

La prueba de citotoxicidad en Artemia salina demostró que tanto en el caso de las flores como en el de las hojas, los extractos presentan una toxicidad muy baja, ya que se necesitan concentraciones muy elevadas para inhibir el 50% de una población, alrededor de 1598 μg/mL para las flores y 628 μg/mL para las hojas, clasificadas como inocuas y ligeramente tóxicas, respectivamente, según la clasificación de toxicidad del CYTED,¹⁰en la cual se describe que en concentraciones mayores que 1 500 µg/mL los extractos son relativamente inocuos y en concentraciones entre 500 y 1 000 µg/mL llegan a tener ligera toxicidad.

La especie M. arboreus, debido a la baja toxicidad que presentan los extractos tanto de sus flores como de sus hojas, es una especie que podría usarse para producir nuevos medicamentos antimutágenos, antitumorales y anticancerígenos, y para eliminar los radicales libres dentro de la célula.

AGRADECIMIENTOS

Al Laboratorio de Análisis Instrumental de la Universidad del Quindío y a su técnico encargado Luis Alfonso Salazar Guerrero MSc. Al Grupo de Investigación Búsqueda de Principios Bioactivos, al Herbario de la Universidad del Quindío y al doctor Leonardo Padilla Sanabria.

Conflicto de intereses

Los autores no tienen conflicto de intereses.

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Recibido: 12 /5/2016.
Aprobado: 18/5/2018.

Laura María Arroyave Murillo. Universidad del Quindío, Armenia. Colombia. Correo electrónico: lmarroyave@uniquindio.edu.co