ARTÍCULO ORIGINAL

Actividad antimicrobiana in vitro de los extractos de Tithonia diversifolia (Hemsl) A. Gray (botón de oro) y de Ageratum conyzoides L. (marrubio)

In vitro antimicrobial activity of extracts of Tithonia diversifolia (Hemsl) A. Gray (tree marygold) and Ageratum conyzoides L . (goatweed)

Beatriz Eugenia López Pino¹
Claudia Patricia Arroyave Sosa²
Diana María Londoño Pérez³
Daniel Fernando López Naranjo⁴
Mónica Liliana Cardona Aristizábal⁵
Carlos Augusto Hincapié Llanos^5*

¹ Centro Educativo Rural Yerbabuenal. Entrerríos, Antioquia, Colombia.
² Institución Educativa Normal Superior Señor de los Milagros. San Pedro de los Milagros, Antioquia, Colombia.
³ Institución Educativa Entrerríos. Entrerríos, Antioquia, Colombia.
⁴ Institución Educativa Luis Eduardo Arias Reinel. Barbosa, Antioquia, Colombia.
⁵ Grupo de Investigaciones Agroindustriales (GRAIN), Facultad de Ingeniería Agroindustrial, Universidad Pontificia Bolivariana. Medellín, Antioquia, Colombia.

RESUMEN

Introducción: Tithonia diversifolia (Hemsl) A. Gray y Ageratum conyzoides L. han sido usadas tradicionalmente en Colombia para tratar diferentes enfermedades, pero hay poca información científica que valide su uso.
Objetivos: Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos de la parte aérea de T. diversifolia y A. conyzoides contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Candida guilliermondii.
Métodos: Se recolectó la parte aérea de ambas plantas en la zona rural de los municipios de Barbosa, Entrerríos y San Pedro de los Milagros, Antioquia, Colombia. La identificación taxonómica se realizó en el herbario de la Universidad de Antioquia. El material vegetal se deshidrató por convección a temperatura ambiente. Las extracciones se realizaron mediante maceración a temperatura ambiente durante 24 h usando etanol, acetato de etilo y hexano como solventes. El solvente se recuperó a presión reducida a 40 °C y el procedimiento se repitió tres veces para cada solvente. Se hicieron las pruebas de sensibilidad, concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB) in vitro. Como control positivo se usó un antibiótico estándar (ampicilina).
Resultados: La bacteria S. aureus mostró sensibilidad con los extractos de T. diversifolia en concentración del 2 % obtenidos con etanol y acetato de etilo (3,66 y 3,32 mm de radio, respectivamente). Ambos extractos tuvieron CMI y CMB de 0,01 g/mL.
Conclusiones: Los extractos obtenidos de T. diversifolia con etanol y acetato de etilo tienen potencial actividad bactericida contra S. aureus.

Palabras clave: actividad bactericida; actividad fungicida; extractos de plantas; Tithonia diversifolia (Hemsl) A. Gray; Ageratum conyzoides L.; marrubio; botón de oro.

ABSTRACT

Introduction: Tithonia diversifolia (Hemsl) A. Gray and Ageratum conyzoides L. have been traditionally used in Colombia to treat a variety of diseases, but there is little scientific information validating their use.
Objectives: Evaluate the antimicrobial activity of extracts obtained from the aerial parts of T. diversifolia and A. conyzoides against Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Candida guilliermondii.
Methods: Aerial parts of the two plants were collected in the rural area of the municipalities of Barbosa, Entrerríos and San Pedro de los Milagros in Antioquia, Colombia. Taxonomic identification was conducted at the herbarium of the University of Antioquia. The plant material was dehydrated by convection at room temperature. Extraction was performed by maceration at room temperature for 24 hours, using ethanol, ethyl acetate and hexane as solvents. The solvent was recovered at reduced pressure and 40 ºC, and the procedure was repeated three times for each solvent. Tests were performed for sensitivity, minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) in vitro. A standard antibiotic (ampicillin) was used as positive control.
Results: The bacterium S. aureus showed sensitivity to the T. diversifolia extracts at a 2 % concentration obtained with ethanol and ethyl acetate (3.66 and 3.32 mm in radius, respectively). Both extracts had an MIC and MBC of 0.01 g/ml.
Conclusions: T. diversifolia extracts obtained with ethanol and ethyl acetate have potential bactericidal activity against S. aureus.

Key words: bactericidal activity, antifungal activity, plant extracts, Tithonia diversifolia (Hemsl) A. Gray, Ageratum conyzoides L., goatweed, tree marygold.

INTRODUCCIÓN

A través de la historia, todas las culturas han incorporado a su vida diaria el conocimiento de las propiedades medicinales de las plantas medicinales. Aún hoy, muchos habitantes de países en vías en desarrollo siguen usándolas debido a sus tradiciones, a los costos y al difícil acceso a las medicinas sintéticas. En Colombia aproximadamente 5 000 especies de plantas han sido usadas tradicionalmente por indígenas y campesinos para tratar enfermedades.¹

Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray (Asteraceae), originaria de Centroamérica,² es utilizada en Colombia para la alimentación animal.³ En el mundo se han demostrado sus efectos bactericida,^4,5 fungicida,^6,7 y su actividad antipalúdica,⁸ antioxidante,⁹ herbicida,¹⁰ insecticida¹¹ y antiinflamatoria^.12 En algunos lugares, los extractos de los tallos y de las hojas se administran por vía oral para tratar los abscesos. Se ha encontrado que el uso repetitivo del extracto acuoso es relativamente seguro, mientras que el extracto polar y el extracto obtenido por el lavado de las hojas con acetona (extracto abundante en sesquiterpen-lactonas) pueden causar daños al hígado y a los riñones, respectivamente.¹³ Además de las sesquiterpen-lactonas, sus hojas contienen alcaloides, fenoles, flavonoides y terpenos.¹⁴

Ageratum conyzoides L. (Asteraceae), originaria de Centroamérica y del Caribe, ha sido usada tradicionalmente en África como febrífugo, purgativo y para tratar ulceras y heridas.¹⁵ Además, en otros lugares se utiliza para tratar las quemaduras, el reumatismo, la neumonía, el dolor de cabeza y los cólicos.¹⁶ Se ha comprobado actividad bactericida^,17,18 fungicida,¹⁹ antimalárica,²⁰ insecticida,²¹ ascaricida,²² anticancerígena y antioxidante in vitro.²³ En cuanto a la toxicidad en mamíferos, se ha encontrado que en ratas la ingestión de 500 y 1 000 mg/kg peso del extracto obtenido mediante la maceración de las hojas con etanol:agua (9:1) puede provocar trastornos hepático y renales, así como daños hematológicos, efectos que pueden ser causados principalmente por los alcaloides de pirrolizidina presentes en la planta.¹⁵ Además, se han encontrado en esta planta cromenos, cromonas, benzofuranos, cumarinas, flavonoides y terpenos, entre otros compuestos.²⁴

Se ha detectado la resistencia de numerosos microrganismos a antibióticos, entre ellos la levadura Candida guilliermondii²⁵ y las bacterias Staphylococcus aureus²⁶ y Escherichia coli.^27,28 La resistencia creciente de los microrganismos patógenos a los antibióticos pone en grave peligro la salud pública y, por tanto, es prioridad buscar nuevas estrategias para tratar los organismos resistentes,²⁹ una de las cuales es utilizar extractos de plantas con propiedades antimicrobianas, ya que la acción, en muchos casos, se debe a la combinación de varios compuestos y no a la acción de uno solo, lo cual dificulta la aparición de resistencias.

El objetivo de este trabajo es evaluar la actividad antimicrobiana in vitro de los extractos obtenidos de la parte aérea de las plantas T. diversifolia y A. conyzoides sobre las bacterias E. coli y S. aureus y la levadura C. guilliermondii.

MÉTODO

Obtención del material vegetal

La parte aérea (tallos, hojas y flores) de T. diversifolia se colectó el 5 de septiembre de 2015 en el km 9 de la vía el Hatillo-Girardota (6°25'16,74"N75°21'28,89"O). El mismo día se colectó la parte aérea de A. conyzoides en el km 7 de la vía San Pedro de los Milagros-Entrerríos (6°28'23,9"N, 75°33'27,6"O), Antioquia, Colombia. Los especímenes fueron depositados en el herbario de la Universidad de Antioquia donde se identificaron taxonómicamente y se registraron con los números de Voucher HUA198377 (T. diversifolia) y HUA198376 (A. conyzoides).

Preparación de los extractos

Todos los procedimientos se realizaron en las instalaciones del laboratorio de Ingeniería Agroindustrial en el Campus de la Universidad Pontificia Bolivariana (UPB) Laureles, Medellín, Colombia.

Se desinfectó el material vegetal y se retiraron las partes dañadas, enfermas y sucias. Posteriormente se deshidrató por convección natural a temperatura ambiente y se redujo de tamaño en un molino manual hasta obtener granos uniformes usando un tamiz con malla 18 según las normas ASTM.³⁰

El material vegetal se maceró sin agitación a temperatura ambiente usando los solventes etanol, acetato de etilo y hexano en una relación 1:10 p/v durante seis días, el solvente se renovó cada 48 h. Después se filtró la mezcla y se recuperó por destilación a presión reducida en roto evaporador (Laborata 2010, Heidolph) a 40 °C y se eliminó cada solvente hasta la sequedad. Los extractos obtenidos se llevaron a una concentración del 2% en agua destilada y esterilizada. Para los extractos obtenidos con acetato de etilo y hexano se agregó Tween 80 al 0,2 % como agente emulsionante.

Preparación del inóculo

Las cepas microbianas se obtuvieron del banco de cepas del laboratorio de Ingeniería Agroindustrial de la UPB conservadas mediante congelación a -70 °C y mediante el sistema de conservación de cultivos bacterianos Cryobank a 4 °C. Para activar y recuperar las cepas de S. aureus, E. Coli y C. guilliermondii se tomó una perla del tubo Cryobank, se colocó en 10 mL de caldo nutritivo y se incubó a 37 °C durante 24 h. Luego se sembró en una superficie sobre la placa del cultivo apropiado y se verificó la pureza.³¹ Para preparar el inóculo se tomaron de cuatro a cinco colonias de cada microorganismo y se pusieron en 5 mL de solución salina al 0,85 %. Las concentraciones se ajustaron con el tubo N° 0,5 de McFarland (1,5 X 10⁶ UFC mL).³²

Prueba de sensibilidad

Se determinó la actividad antimicrobiana de los extractos de ambas plantas mediante la técnica de difusión en pozo.³³ El medio se preparó en medio agar Mueller-Hinton (MH) según las indicaciones de la etiqueta y se conservó en estado líquido a 45 °C. En cada caja de Petri se vertieron 50 µL por microorganismo y 20 mL del medio MH, y se homogeneizó la mezcla. Después de 15 min con ayuda de un sacabocados estéril se realizaron tres pozos de 3 mm de diámetro con bordes uniformes por caja y se adicionaron 50 µL de los extractos al 2 % en cada pozo.

El control negativo se preparó usando agua destilada y esterilizada y Tween 80 al 0,2 %. Para el control positivo se usaron los anteriores ingredientes más 1 g/mL de ampicilina comercial (antibiótico). Todas las muestras se llevaron a una incubadora a 37 °C durante 24 h. Se realizó la lectura de la susceptibilidad antimicrobiana mediante observación y medición del halo de inhibición alrededor de cada pozo. Los ensayos se realizaron por triplicado.

Concentración mínima inhibitoria

La concentración mínima inhibitoria (CMI) es la más baja concentración de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un microorganismo después de 24 h de incubación.³⁴ Para cada microorganismo y cada extracto se determinaron las CMI y las concentraciones mínimas bactericidas mediante el método de las diluciones seriadas en caldo nutritivo.³⁵ Se tomaron 10 tubos de ensayo con 1 mL de caldo nutritivo en cada uno y se adicionó 1 mL de cada extracto en diluciones seriadas en las siguientes concentraciones (g/mL): 0,01; 0,005; 0,0025; 0,00125; 6,25x10^-4; 3,13x10^-4; 1,56x10^-4; 7,81x10^-5; 3,91x10^-5 y 1,95x 10^-5. Posteriormente se inoculó 1 mL de solución microbiana a una escala de turbidez de McFarland N°. 0,5, para cada uno de los diez tubos. Se incluyó un control positivo (caldo nutritivo al que se le añadió una suspensión microbiana sin extracto) y un control negativo (caldo nutritivo sin extracto y sin suspensión microbiana). Se incubaron por 24 h a 37 ºC. La prueba se realizó por triplicado. En aquellos casos donde se observó inhibición se sembró caldo nutriente sin agente antimicrobiano en una placa que contenía el medio específico.³⁶

Concentración mínima bactericida

La concentración mínima bactericida es la más baja concentración de un antimicrobiano que puede prevenir el crecimiento de un organismo después de hacer un subcultivo sobre un medio sin antibiótico después de 24 h de incubación.³⁴ Los tubos que no presentaron crecimiento durante la prueba de concentración máxima inhibitoria se subcultivaron (100 μL) en cajas con agar para verificar el crecimiento. Esta suspensión fue inoculada en placas de Petri debidamente rotuladas con la concentración correspondiente, luego se añadió agar Mueller-Hinton (MH) a 45 ºC aproximadamente. Se utilizó como control positivo agar MH con 100 μl de inóculo sin solución antimicrobiana y como control negativo, agar MH sin inóculo y sin solución antimicrobiana. Las placas se dejaron incubar durante 24 h a 35 °C. Los aislados demostraron ser sensibles al extracto cuando no hubo crecimiento en las placas después de 24 h de incubación. La prueba se realizó por triplicado.³⁷

Análisis estadístico

Para la prueba de sensibilidad, cada caja de Petri constituyó una repetición. Para cada microorganismo se realizó un diseño completamente al azar con ocho tratamientos (tres extractos de T. diversifolia, tres de A. conyzoides, un control negativo y uno positivo) con tres repeticiones cada uno. Con los datos obtenidos se realizó un análisis de varianza (ANOVA) con un nivel de confianza del 95 % y cuando se encontraron diferencias estadísticamente significativas (DES), por lo menos entre dos de los tratamientos, se aplicó la prueba de Tukey para determinar entre cuáles tratamientos existieron diferencias. Para esto se usó el programa Statgraphics Centurion® XVII (Statgraphics Technologies, Inc. The Plains, Virginia. EUA).

RESULTADOS

Rendimientos de deshidratación y de extracción

Del material vegetal deshidratado se determinó que los rendimientos de deshidratación fueron 17,7 % para T. diversifolia y 18,6 % para A. conyzoides. Los rendimientos de extracción para T. diversifolia fue 6,14 % con etanol, 4,11 % con acetato de etilo y 1,63 %con hexano como solventes. Para el caso de A. conyzoides los rendimientos fueron 7,87 % usando etanol; 6,78 % con acetato de etilo y 4,80 % con hexano como solventes.

Prueba de sensibilidad

No se presentaron halos de inhibición en las pruebas realizadas para C. guilliermondii y E. coli con ninguno de los extractos , por tanto, no se realizó el ANOVA para dichos experimentos ni más pruebas con dichos microorganismos.

En las pruebas con S. aureus se presentaron halos de inhibición con los extractos obtenidos de T. diversifolia usando acetato de etilo (TAE) y etanol (TE). Para S. aureus se verificaron los supuestos de la ANOVA (prueba de Shapiro-Wilk y Levene), posteriormente se realizó la ANOVA y se encontró que existen diferencias significativas, por lo menos, entre dos de los tratamientos (valor de p = 0,0000). Mediante la prueba de Tukey se comprobó que los tratamientos realizados con los extractos obtenidos con acetato de etilo y con etilo a partir de T. diversifolia no presentaron diferencias estadísticamente significativas entre ellos con respecto al diámetro de los halos, pero se diferencian significativamente de los tratamientos realizados con el extracto hexánico de la misma planta y con los extractos obtenidos a partir de A. conyzoides y también de los dos controles. Los diámetros del halo de ambos tratamientos son significativamente mayores con respecto al del control negativo y menores con respecto al del control positivo (Tabla 1).

Los promedios con la misma letra no presentan diferencias estadísticamente significativas según la prueba de Tukey (p< 0,05).

Concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida

Se determinó la concentración mínima inhibitoria de los extractos obtenidos de T. diversifolia con acetato de etilo y etanol, ya que presentaron actividad en la prueba de sensibilidad contra S. aureus. Con esta prueba se confirmó la sensibilidad del microorganismo a estos extractos debido a que ambos causaron inhibición con una concentración de 0,01 g/mL determinada por la ausencia de turbidez. En los ensayos realizados en menores concentraciones se evidenció turbidez en el medio, lo cual indicó crecimiento microbiano.

La concentración mínima bacteriana de ambos extractos de T. diversifolia contra la cepa de S. aureus corresponde a una concentración de 0,01 g/mL. A medida que disminuye la concentración del extracto aumenta el crecimiento bacteriano (Tabla 2).

DISCUSIÓN

Los extractos de T. diversifolia obtenidos con acetato de etilo y etanol mostraron actividad bactericida in vitro contra la bacteria S. aureus, pero no contra E. coli ni C. guilliermondii . Estos resultados tienen un comportamiento semejante al que observaron Liasu y Ayandele³⁸ quienes evaluaron, entre otros, los extractos etanólicos de los tallos y de las hojas de esta planta y obtuvieron diámetros de halo de inhibición de 18 y 8 mm y concentraciones máximas inhibitorias (CMI) igual a 0,01 g/mL y mayor que 0,1 g/mL, respectivamente. La CMI obtenida del tallo con el extracto etanólico en el mencionado trabajo es igual a la CMI obtenida de la parte aérea de la planta con el mismo tipo de extracto en la presente investigación.

Se puede observar un comportamiento similar entre los resultados de este estudio y los de Obafemi y otros,³⁹ quienes observaron actividad del extracto obtenido de esta planta usando acetato de etilo (al 0,2 %) frente a S. aureus y obtuvieron un halo de inhibición promedio de 16 mm (en este trabajo se obtuvo un promedio de 7,33 mm al 2 %). Los mencionados investigadores probaron también con extracto hexánico sin encontrar actividad. Sin embargo, a diferencia de este estudio, estos investigadores obtuvieron halos de inhibición sobre E. coli con los extractos obtenidos con hexano y acetato de etilo. En ese trabajo, después de 3 ensayos biodirigidos, se aisló el compuesto sesquiterpen-lactona 1 del extracto obtenido con acetato de etilo, pero cuando este compuesto se probó en S. aureus no presentó actividad, por lo que se llegó a la conclusión de que puede ser otro u otros los compuestos responsables de la acción o una sinergia entre algunos compuestos presentes en los extractos.

El trabajo realizado por Ogundare⁴⁰ muestra una tendencia similar a la encontrada en este estudio. A pesar de usar solventes diferentes, se observan polaridades cercanas a las usadas en esta investigación. Este investigador encontró halos de 20 y 12 mm y CMI de 0,003125 y 0,00625 g/mL usando cloroformo (medianamente polar) y metanol (polar), respectivamente, sobre S. aureus. Los extractos usados en los estudios de Ogundare⁴¹ y de Obafemi y otros⁴⁰ son más efectivos (mayores diámetros del halo y menores CMI) y muestran que hay coincidencia en la naturaleza de los extractos que tienen esta actividad. Las diferencias pueden deberse a las diferentes composiciones de los metabolitos secundarios en las plantas con diversos orígenes y también a la variada resistencia a las sustancias antibióticas que pueden presentarse entre las distintas poblaciones de la misma especie de microorganismos.

En la investigación realizada por Ogundare ⁴⁰ se evaluaron también los extractos contra E. coli sin encontrar actividad, tal como sucedió en este estudio.

No se encontró actividad bactericida de A. conyzoides contra S. aureus, lo cual coincide con lo que encontraron Akinyemi y otros⁴¹ contra una cepa de esta bacteria resistente a la meticilina cuando evaluaron el extracto etanólico de esta planta. Estos resultados llevaron a la conclusión de suspender el uso de la meticilina en la medicina tradicional de Lagos, Nigeria.

Ngemenya y otros⁴² probaron varios extractos, incluido el que se obtuvo con el acetato de etilo, sobre la misma bacteria y obtuvieron también resultados negativos. Por su parte, Adetutu y otros¹⁸ encontraron actividad del extracto etanólico de esta planta y constataron halos de inhibición de 17 mm y CMI de 0,0002 g/mL.

En este estudio no se observó actividad bactericida de A. conyzoides frente a E. coli, lo que contrasta con lo encontrado en otros trabajos. En una investigación realizada en Nigeria, el extracto etanólico de esta planta causó halos de inhibición de 12 mm y una CMI de 150 µg/mL (0,00015 g/mL).¹⁸ En un estudio llevado a cabo en Camerún, se encontró que contra E. coli el extracto de A. conyzoides obtenido con acetato de etilo, y después con metanol, causó un halo de inhibición de 19 mm (método de difusión en disco) y una CMI de 0,0025 g/mL.⁴² Estos resultados indican que la actividad de la planta puede variar sobre la misma especie de microrganismo, bien por la cepa evaluada, bien por las diferencias que pueden existir entre plantas de la misma especie debido a los diferentes lugares geográficos donde crecen estas plantas y a los aspectos agro-climatológicos a los que están sometidas, lo que puede causar diferencias en el contenido y la concentración de los metabolitos responsables de determinada actividad.

No se hallaron resultados en la literatura científica con los cuales comparar los resultados de los extractos obtenidos de A. conyzoides frente a C. guilliermondii, excepto por un trabajo realizado con el aceite esencial de esta planta que demostró resultados promisorios.⁴³ Por primera vez se informa la actividad fungicida de los extractos de T. diversifolia contra C. guilliermondii.

Los resultados de este estudio indican que el uso de A. conyzoides en la medicina tradicional colombiana para tratar las enfermedades causadas por S. aureus, E. coli y C. guilliermondii, debe ser revisado debido a su actividad nula, por tanto, deben realizarse estudios con otros materiales vegetales de la misma especie recolectados en otras regiones y que la planta debe evaluarse contra otras cepas de estos microrganismos. También debe hacerse otro estudio para demostrar el uso de la planta T. diversifolia para tratar enfermedades causadas por E. coli y C. guilliermondii.

Deben realizarse más investigaciones para aislar e identificar el compuesto o los compuestos responsables de la actividad de T. diversifolia contra S. aureus. Asimismo, deben evaluarse los efectos que pueden tener los extractos que poseen actividad sobre la salud humana o animal antes de continuar con su uso en la medicina tradicional.

Agradecimientos

A la Secretaría de Educación de Antioquia por la financiación de los estudios de maestría, a la Universidad Pontificia Bolivariana, a Javier Roldán Palacio por la identificación botánica de las plantas y a las institucioneseEducativas de Entrerríos, Luis Eduardo Arias Reinel, Centro Educativo Rural Yerbabuenal y Normal Superior Señor de los Milagros.

Conflicto de intereses

Los autores plantean que no tienen conflicto de intereses.

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Recibido: 11/04/2018
Aprobado: 12/06/2018

Carlos Augusto Hincapié Llanos. Universidad Pontificia Bolivariana. Medellín, Colombia. Correo electrónico: carlos.hincapie@upb.edu.co