ARTÍCULO ORIGINAL

Prospecção fitoquímica e modulação da atividade antibiótica de Cyperus rotundus L. contra bactérias multirresistentes

Estudio fitoquímico y modificación de la actividad antibiótica de Cyperus rotundus L. contra bacterias multirresistentes

Phytochemical prospection and modulation of the antibiotic activity of Cyperus rotundus L. against multiresistant bacteria

Nair Silva Macedo¹
Zildene de Sousa Silveira¹
Thiago Sampaio de Freitas²
Ana Raquel Pereira da Silva²
José Galberto Martins da Costa¹
Henrique Douglas Melo Coutinho^2*
Francisco Assis Bezerra da Cunha¹

¹ Laboratório de Bioprospecção do Semiárido, Universidade Regional do Cariri, Crato, Ceará. Brasil.
² Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Universidade Regional do Cariri, Crato, Ceará. Brasil.

RESUMO

Introdução: Cyperus rotundus L. é uma planta da família Cyperaceae podendo ser uma alternativa para o tratamento de doenças e infecções por apresentar atividades antimicrobianas.
Objetivos: Determinar a composição química do extrato aquoso da inflorescência de C. rotundus (E.A.I.C.R.) e avaliar sua atividade antimicrobiana e moduladora da atividade antibiótica frente às cepas de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli.
Métodos: O material botânico (inflorescências), coletado no Parque de Exposições Pedro Felício Cavalcante, Crato, CE, Brasil, foi submerso em água destilada, filtrado e submetido a liofilização. O E.A.I.C.R. teve sua composição química identificada através de uma prospecção química e foi testado contra às cepas de bactérias padrões de E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 25923,S. aureus ATCC 6538 e as cepas multirresistentes de E. coli 06, P. aeruginosa 24 e S. aureus 10.
Resultados: A caracterização química qualitativa revelou a presença de flavonas, flavonóis, xantonas, chalconas, auronas, flavononóis e catequinas. Não foi encontrada atividade bacteriana clinicamente relevante do extrato. No entanto, a modulação com o antibiótico Norfloxacina apresentou antagonismo para S. aureus e sinergismo para E. coli.
Conclusão: Nossos dados demonstraram que o E.A.I.C.R. possui um potencial na modulação do antibiótico Norfloxacina contra a cepa multirresistente de Escherichia coli 06. Novos estudos precisam ser realizados visando a determinar seu mecanismo de ação.

Palavras chaves: sinergismo; interação medicamentosa; metabólitos secundários.

RESUMEN

Introducción: Cyperus rotundus L. es una planta de la familia Cyperaceae y puede ser una alternativa para el tratamiento de enfermedades e infecciones debido a su actividad antimicrobiana.
Objetivos: Determinar la composición química del extracto acuoso de la inflorescencia de C. rotundus (E.A.I.C.R.) y evaluar su actividad antimicrobiana y modificadora de la actividad antibiótica contra Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli.
Métodos: El material botánico (inflorescencias), recogido en el Parque de Exposiciones Pedro Felício Cavalcante, ubicado en el municipio de Crato, estado de Ceará, Brasil, se sumergió en agua destilada, se filtró y se liofilizó. Se identificó la composición química del E.A.I.C.R. mediante exploración química y fue probado contra las cepas de bacterias patrones de E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 25923, S. aureus ATCC 6538 y las cepas multirresistentes de E. coli 06, P. aeruginosa 24 y S. aureus 10.
Resultados: La caracterización química cualitativa mostró la presencia de flavonas, flavonoides, xantonas, chalconas, auronas, flavononas y catequinas. El extracto no mostró actividad bacteriana clínicamente relevante. Sin embargo, la modificación del antibiótico Norfloxacina mostró antagonismo en presencia de S. aureus y sinergia frente a E. coli.
Conclusión: Nuestros datos demostraron que el E.A.I.C.R. tiene la posibilidad de modificar la acción del antibiótico Norfloxacina contra la cepa multirresistente de Escherichia coli 06, pero deben realizarse nuevos estudios para determinar el mecanismo de acción.

Palabras clave: sinergismo; interacción medicamentosa; metabolitos secundarios.

ABSTRACT

Introduction: Due to its antimicrobial activity, Cyperus rotundus L. (Cyperaceae) may be an alternative for the treatment of infections and diseases.
Objectives: Determine the chemical composition of the aqueous extract of C. rotundus inflorescences (AECRI), evaluate its antimicrobial activity and verify its antibiotic effect againstStaphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.
Methods: The plant material (inflorescences) collected at Pedro Felício Cavalcante Exhibition Park in the municipality of Crato, state of Ceará, Brazil, was submerged in distilled water, filtered and lyophilized. The chemical composition of the AECRI was identified by chemical exploration. Determination was then performed of its action against standard bacterial strains of E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 25923, S. aureus ATCC 6538 and the multi-resistant strains of E. coli 06, P. aeruginosa 24 and S. aureus 10.
Results: Qualitative chemical characterization revealed the presence of flavones, flavonols, xanthones, chalcones, aurones, flavonones and cathechins. The extract did not exhibit any clinically relevant bacterial activity. However, the antibiotic Norfloxacin displayed antagonism in the presence of S. aureus and synergy against E. coli.
Conclusion: Data showed that the AECRI may modify the action of the antibiotic Norfloxacin against the multi-resistant strain of Escherichia coli 06, but further research should be conducted to determine the mechanism of action.

Key words: synergy; drug interaction; secondary metabolites.

INTRODUÇÃO

Em decorrência do uso indiscriminado de antibióticos tem crescido os casos de resistência microbiana a essas drogas.^1. Sendo assim produtos obtidos a partir de plantas vêm ganhando importância mundialmente para o tratamento de doenças causadas por bactérias, devido à presença de fitoquímicos encontrados em muitas plantas medicinais.²

Cyperus rotundus L. é uma erva daninha da família Cyperaceae conhecida popularmente como tiririca e está distribuída em mais de noventa países da região tropical e subtropical.³ Esta planta cresce cerca de 100 cm de altura, possuindo rizomas escamosos com bulbos na base que surgem de forma isolada dos tubérculos, chegando a alcançar de 1 a 3 cm de comprimento, as hastes chegam até 25 cm de altura, suas folhas apresentam coloração verde escura, possuem inflorescências pequenas com 2 a 4 brácteas tendo pequenas flores de cor marrom avermelhada.²

Dentre as bactérias Gram-positivas, Staphylococcus aureus normalmente é encontrada na pele e nas fossas nasais de pessoas saudáveis, podendo vir a provocar pequenas infecções como espinhas, furúnculos, foliculite, até infecções graves como pneumonia e meningite.⁴ Outra bactéria, Pseudomonas aeruginosa, está associada a infecções principalmente do trato urinário e ainda infecções hospitalares, acometendo, sobretudo, pacientes imunossuprimidos.⁵ A bactéria Gram-negativa Escherichia coli é uma das principais causadoras de infecções, sendo conhecida por produzir enterotoxinas responsáveis por intoxicações alimentares.⁶ Em virtude do uso irregular de antibióticos, o aumento da resistência destas bactérias às drogas têm se tornado um problema frequente do ponto de vista clínico e saúde pública. Por esta razão são importantes novos estudos que visem à descoberta de novos fármacos de origem natural.⁷ Segundo a metodologia descrita por Coutinho e colaboradores, muitos produtos naturais apresentam ação direta sobre algumas espécies de bactérias e também podem atuar como modificadores da atividade antimicrobiana de antibióticos, de modo sinérgico ou antagônico.⁸

Em um estudo realizado por Matias e colaboradores eles verificaram que o extrato metanólico de Ocimum gratissimum L. mostrou uma ação sinérgica contra cepas multirresistentes de S. aureus e E. coli.⁹ Em outro trabalho, o óleo essencial de Cymbopogon citratus demonstrou ação antibacteriana, além de possibilitar seu uso associado com antibióticos frente às cepas de bactérias tanto Gram-positivas como Gram-negativas.¹⁰

Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi identificar a composição química do extrato aquoso de inflorescência de C. rotundus (E.A.I.C.R.) e avaliar sua atividade antimicrobiana e moduladora da ação antibiótica frente às cepas deS. aureus, P. aeruginosa e E. coli.

MATERIAL E MÉTODOS

Coleta da planta

O material botânico de Cyperus rotundus L. foi coletado às 16:00 ± 00:30 h no Parque de Exposições "Pedro Felício Cavalcante", Crato, CE, Brasil. (Coordenadas: 07° 14' 25,7" de latitude S. e 39° 24' 48,1" longitude W. do Greenwich). Foram preparadas exsicatas e identificadas pela Profa. Dra. Maria Arlene Pessoa da Silva como pertencente à espécie Cyperus rotundus L., da família Cyperaceae. Um voucher foi depositado no Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima, da Universidade Regional do Cariri-URCA sob o número 12.927.

Concentração do extrato

Para preparação do extrato foram coletadas plantas inteiras das quais foram separadas as sementes e inflorescências obtendo-se 77 g do material verde, sendo submersas em 1,5 L de água destilada por 3 h à temperatura de 80 °C, após este período, foi filtrado, armazenado em recipientes de plástico de 150 mL e levados ao freezer para congelamento, em seguida o extrato foi liofilizado em liofilizador modelo Liotop L101, acondicionado em vidro âmbar e armazenado em congelador.

Prospecção química qualitativa

Os ensaios químicos foram realizados para a análise qualitativa da presença de metabólitos secundários. Os testes de detecção para avaliar a presença de taninos, fenóis, flavonóides e alcaloides foram realizados de acordo com a metodologia descrita por Matos.¹¹ Os ensaios basearam-se na observação visual das modificações de cor e a formação de precipitado após a adição de reagentes específicos.

Cepas microbianas

Os microrganismos utilizados nos testes foram obtidos do Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular (LMBM) da Universidade Regional do Cariri (URCA). Foram utilizadas linhagens padrões: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 e linhagens multirresistentes:Staphylococcus aureus 10, Pseudomonas aeruginosa 24 eEscherichia coli 06 como está representado na tabela 1.

Preparo das substâncias e antibióticos

Todas as substâncias (extrato e antibióticos) utilizadas nos testes microbiológicos foram diluídos até ser obtida uma concentração padrão de 1024 µg/mL. O E.A.I.C.R. foi preparado diluindo-se 10 mg do extrato em 9,765 mL de água destilada. Os antibióticos utilizados foram a Norfloxacina e Gentamicina e foram preparados de acordo com as especificações do fabricante.

Preparo dos inóculos e determinação da concentração inibitória mínima (CIM)

Foi adotado neste teste o procedimento de microdiluição em caldo recomendado por NCCLS M7-A6.⁽¹²⁾ As culturas de bactérias foram semeadas em placas de Petri contendo Ágar de Infusão de Coração (HIA - Heart Infusion Agar) e incubadas a 37 °C para crescimento por 24 h. Após esse período, foi realizado um arrasto de cada cultura microbiana e diluído em tubos de ensaio, em triplicata. Após esse procedimento, foi testada a turbidez da solução com um controle de McFarland.

A solução final do inóculo foi preparada em Eppendorfs, cada um contendo 1350 μL de Infusão de Cérebro e Coração (BHI - Brain Heart Infusion) a 10 % + 150 μL do inóculo (correspondente a 10 % da solução total) para a CIM. A solução foi preparada em triplicata para cada bactéria.

Foram adicionados 100 μL da solução final dos inóculos em cada poço da placa de microdiluição de 96 poços e em seguida foi feita a diluição seriada com a solução de 100 μL do extrato, por coluna, variando nas concentrações de 512 μg/mL no primeiro poço a 0,5 μg/mL no último poço. As microdiluições foram realizadas em triplicata. As placas foram levadas à incubadora por 24 h a 37º C. A leitura para determinação da CIM bacteriana foi feita utilizando-se a adição de 20 μL de resazurina em cada poço e observação ocular após 1 hora.¹³

Modulação da atividade antibiótica por contato direto

Para verificar a modulação do efeito antibacteriano dos antibióticos frente às cepas testadas, foi utilizado o método proposto por Coutinho e colaboradores.¹⁴ Foram preparados tubos Eppendorf contendo, cada um deles: 188 μL do extrato, volume correspondente a concentração sub-inibitória (CIM/8); 150 μL da suspensão bacteriana (correspondente a 10 % da solução) e 1 162 μL de BHI 10 %. Para o controle foram preparados tubos Eppendorf com 1,5 mL de solução contendo 1 350 μL de BHI (10 %) e 150 μL de suspensão de microrganismos. A placa foi preenchida no sentido numérico adicionando-se 100 μL desta solução em cada poço. Em seguida foi feita a microdiluição seriada com 100 μL do antibiótico.

Análise estatística

Os dados foram analisados através do programa estatístico GraphPad Prisma 5.0. Foi realizado um teste ANOVA de duas vias, utilizando a média geométrica das triplicatas como dado central e o desvio padrão da média. Em seguida foi feito um teste de Bonferroni post hoc (onde p< 0,05 e p< 0,0001 são considerados significativo e p> 0,05 não significativo).

RESULTADOS

Prospecção fitoquímica

O rendimento do E.A.I.C.R. foi de 2,597 %. A caracterização química qualitativa demonstrou a presença das seguintes classes de metabólitos secundários: flavonas, flavonóis, xantonas, chalconas, auronas, flavononóis, catequinas e flavononas como representado na tabela 2.

Nidugala e colaboradores utilizando a técnica de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-MS) para a caracterização dos compostos solúveis em n-hexano do extrato dos rizomas de C. rotundus identificaram a presença dos fitoquímicos: fenóis (cyperone), terpenos (eicosano, hentaiacontano, triacontano, pentatriacontano) e o esterol (sitosterol gama). Estes constituintes podem explicar suas bioatividades.¹⁵

Concentração inibitória mínima (CIM)

Analisando os dados observa-se que os resultados da atividade antimicrobiana indicando a CIM obtida de E.A.I.C.R. sobre as estirpes padrões e multirresistentes das bactériasStaphylococcus aureus (ATCC 6538 e SA10), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923 e PA24) e Escherichia coli (ATCC 25922 e EC06) apresentou um valor da CIM ≥ 1 024 µL para todas as cepas.

Modulação

O ensaio modulador com antibióticos foi realizado para avaliar a interação entre o E.A.I.C.R. e os antibióticos Gentamicina e Norfloxacina, a fim de verificar se há atividade moduladora sinérgica ou antagônica. Não houve interações estatisticamente significantes para o antibiótico Gentamicina, conforme a tabela 3.

A figura mostra que o E.A.I.C.R. quando associado a Norfloxacina possui uma ação antagônica pois é necessária uma maior concentração do antibiótico para inibir o crescimento da bactéria S. aureus.

O E.A.I.C.R. não apresentou atividade moduladora estatisticamente significante quando associado à Norfloxacina frente às cepas de P. aeruginosa.

Já para a bactéria E. coli os resultados foram relevantes na modulação quando o E.A.I.C.R. foi associado à Norfloxacina, havendo uma redução na concentração do antibiótico necessária para a inibição do crescimento da bactéria E. coli, sendo caracterizado por uma ação sinérgica.

DISCUSSÃO

Rendimento dos extratos e prospecção fitoquímica

O baixo percentual de rendimento do extrato está associado a grande quantidade de fibras presentes na inflorescência e sementes da tiririca. Outro fator importante é o fato do extrato ser aquoso o que por sua natureza dissolve apenas metabólitos compatíveis com sua polaridade.

Concentração Inibitória Mínima

Estudos realizados por Dadook e colaboradores demonstraram que o extrato etanólico de tubérculos de C. rotundus apresentou atividade antimicrobiana contra P. aeruginosa.¹⁶ Nesse estudo foram utilizados dois métodos, o primeiro foi o método de difusão em disco obtendo-se uma CIM de 25 mg/mL para todas as cepas testadas, padrões e multirresistentes, enquanto que para o método de microdiluição em caldo, sendo considerado o mais adequado houve uma redução na CIM para 0,1 mg/mL.

Modulação da atividade antimicrobiana pela Gentamicina e Norfloxacina

C. rotundus possui bioatividades sendo assim fonte potencial de antioxidantes naturais e apresenta citoxidade estando esses efeitos biológicos relacionados a compostos fenólicos como os taninos e flavonóides.¹⁷ Embora nosso trabalho não tenha apresentado atividade antibacteriana com o extrato aquoso da inflorescência, uma avaliação feita por Sharma y Singh a partir do extrato etanólico de rizomas de C. rotundus comprovou a atividade antibacteriana contra a bactéria E. coli podendo esse resultado ser referente à presença de metabólitos secundários tais como fenóis, terpenos e esteróides.¹⁸

Em estudo realizado por Parekh y Chanda para avaliar a atividade antimicrobiana in vitro do extrato aquoso e etanólico de plantas inteiras de C. rotundus foi relatado que a eficácia dos compostos botânicos da planta está relacionada diretamente ao solvente utilizado no processo de extração, sendo que o extrato etanólico de C. rotundus apresentou cerca de 70 % de atividade antimicrobiana em todos os microrganismos investigados, tendo mais eficiência contra a maioria das bactérias Gram-negativas testadas como a E. coli, enquanto o extrato aquoso não manifestou atividade antimicrobiana.¹⁹

Avaliando o efeito antimicrobiano in vitro de diversas plantas dentre elas C. rotundus no qual foram utilizados solventes como o clorofórmio, metanol, acetona e água sobre cepas de bactérias Gram-positivas, S. aureus e Gram-negativas, P. aeruginosa e E. coli foi verificado que o metanol apresentou uma maior eficácia na extração dos compostos com efeito antimicrobiano com maior efeito sobre S. aureus, podendo esse efeito está associado possivelmente as diferenças morfológicas ligadas a composição da parede celular das bactérias Gram-positivas.²⁰ Segundo Cechinel Filho e Yunes o solvente metanol, em casos de extratos que apresentam efeitos biológicos, é o mais adequando para a extração de extratos brutos possibilitando uma extração de maior número de compostos.²¹

Na literatura não existe estudos que relatem o efeito de modulação da atividade antibiótica do extrato deC. rotundus sobre cepas de bactérias, S. aureus, P. aeruginosa e E. coli, sendo este um estudo inédito. No entanto esta metodologia de modulação é robusta envolvendo estudos com outras plantas como Mentha arvesis L. foi verificada uma ação moduladora da atividade antibiótica, havendo uma redução alta na CIM para gentamicina na estirpeE. coli 27.⁸ Os resultados do estudo realizado porCoutinho e colaboradores demonstrou que os extratos de Croton campestris A. St.-Hil e Ocimum gratissimum L. possuem atividade moduladora quando associado a Norfloxacina se observou um aumento da zona de inibição com percentual variando 0 e 50 % em comparação com a zona de inibição da Norfloxacina isolada, o que indica que estes extratos afetam a capacidade da bomba de efluxo norA, pois esta é a causa da resistência da estirpe SA1119B contra Norfloxacina.¹³

Nossos dados demonstraram que o E.A.I.C.R. possui um potencial na modulação do antibiótico Norfloxacina contra a cepa multirresistente de Escherichia coli 06. No entanto demonstrou possuir antagonismo quando associado com o mesmo antibiótico contra a cepa multirresistente de Staphylococcus aureus 10. O que demonstra uma possível interação medicamentosa que pode ser prejudicial à saúde. Novos estudos necessitam ser realizados utilizando-se outros solventes, visando a se identificar o potencial modulador deste extrato.

Conflito de interesses

Os autores referem no conflito de interesse.

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Recibido: 18/12/2016.
Aprobado: 8/5/2018.

Henrique Douglas Melo Coutinho. Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Universidade Regional do Cariri, Crato, Ceará. Brasil. Correo electrónico: hdmcoutinho@gmail.com