ARTÍCULO ORIGINAL

Atividade antioxidante e fotoprotetora do extrato etanólico de Ocimum gratissimum L. (alfavaca, Lamiaceae)

Actividad antioxidante y fotoprotectora del extracto etanólico de Ocimum gratissimum L. (alfavaca, Lamiaceae)

Antioxidant and photoprotetic activity of ethanolic extract from Ocimum gratissimum L. (clove basil)

Carla Bianka Santana Vieira¹
José Fábio França Orlanda^2*

¹ Faculdade de Imperatriz (FACIMP), Imperatriz - MA, Brasil.
² Universidade Estadual da Região Tocantina do Maranhão (UEMASUL) Centro de Ciências Exatas, Naturais e Tecnológicas (CCENT) - Laboratório de Biotecnologia Ambiental - LABITEC - MA, Brasil.

RESUMO

Introdução: Nas últimas décadas observa-se grande interesse pelo potencial terapêutico das plantas medicinais, com resultados muito promissores para a busca de novas substâncias bioativas com atividade fotoprotetor. A espécie botânica Ocimum gratissimum L. é uma planta pertencente à família Lamiaceae, popularmente conhecida como alfavaca, alfavação ou alfavaca-cravo, apresentando atividade no tratamento de diversas patologias sem comprovação científica da sua eficiência.
Objetivo: Avaliar in vitro a atividade fotoprotetora, antioxidante e fitoquímica do extrato etanólico bruto das folhas de O. gratissimum.
Métodos: A atividade fotoprotetora do extrato etanólico bruto de O. gratissimum foi determinada calculando o fator de proteção solar pelo método de Mansur. A triagem fitoquímica dos metabólitos secundários foi realizada segundo metodologias de reações químicas cromogênicas ou precipitação. A capacidade antioxidante foi realizada pelo método de método DPPH em triplicata.
Resultados: Os resultados mostraram que o extrato apresentou elevada capacidade antioxidante (EC₅₀) de 35,22 ± 0,33 μg.mL^-1 , devido a presença de compostos fenólicos (86,11 mg de GAE/g extrato ± 0,02), taninos (32,06 mg de CE/g extrato ± 0,04) e flavonoides (44,85 mg de QUE/g extrato ± 0,09). O valor do FPS encontrado para as concentrações de 0,01 a 0,09 μg.mL ^-1, apresentaram FPS ≥ 6,0, classificando o extrato como um possível protetor solar de origem natural.
Conclusão: O extrato etanólico bruto de O. gratissimum apresenta constituintes químicos com potencial terapêutico para ser utilizado como fotoprotetor de origem natural. No entanto, mais estudos são necessários para testar a capacidade de potencializar filtros solares em formulações cosméticas.

Palavras-chave: Ocimum gratissimum L., fator de proteção solar, fotoproteção.

RESUMEN

Introducción: En las últimas décadas ha habido un gran interés en el potencial terapéutico de las plantas medicinales con resultados muy prometedores para buscar nuevas sustancias bioactivas con actividad fotoprotectora. La especie botánica Ocimum gratissimum L. es una planta de la familia Lamiaceae, conocida popularmente como albahaca, albahaca silvestre o albahaca salvaje usada en el tratamiento de diversas enfermedades, aunque sin evidencia científica de su efectividad.
Objetivo: Evaluar la actividad fotoprotectora, antioxidante y fitoquímica in vitro del extracto etanol bruto de O. gratissimum.
Métodos: Se determinó la actividad fotoprotectora del extracto de etanol de O. gratissimum mediante el cálculo del factor de protección solar con el método de Mansur. Se realizó el tamizaje fitoquímico de los metabolitos secundarios mediante métodos cromogénicos, reacciones químicas o precipitación. La capacidad antioxidante se determinó mediante el método de DPPH por triplicado.
Resultados: Los resultados mostraron que el extracto tenía una alta capacidad antioxidante (EC₅₀) de 35,22 ± 0,33 μg.mL^-1 debido a la presencia de compuestos fenólicos (86,11 mg de ácido (GAE) / g de extracto ± 0,02), taninos (32,06 mg de catequina (CE)/g de extracto ± 0:04) y flavonoides (44,85 mg de quercitina (QUE)/ g de extracto ± 0:09). El valor del factor de protección solar (FPS) encontrado para las concentraciones 0,01 a 0,09 μg.mL^-1 fue mayor o igual que 6,0 por lo que el extracto clasifica como un posible protector solar de origen natural.
Conclusión: El extracto de etanol de O. gratissimum tiene componentes químicos con potencial terapéutico para su uso como protector solar de origen natural. Sin embargo, se necesitan más estudios para probar la capacidad de mejorar los protectores solares en las formulaciones cosméticas.

Palabras clave: Ocimum gratissimum L.; factor de protección solar; protección solar.

ABSTRACT

Introduction: The last decades have witnessed great interest in the therapeutic potential of medicinal plants, with very promising results in the search for new bioactive substances with photoprotective activity. The species Ocimum gratissimum L. is a plant from the Lamiaceae family commonly known as clove basil, African basil and wild basil, used to treat a variety of diseases, but with no scientific evidence of its effectiveness.
Objective: Evaluate the in vitro photoprotective, antioxidant and phytochemical activity of crude ethanolic extract from O. gratissimum.
Methods: Determination was made of the photoprotective activity of O. gratissimum ethanolic extract estimating the sun protection factor with the Mansur method. Phytochemical screening of secondary metabolites was based on chromogenic methods, chemical reactions or precipitation. Antioxidant capacity was determined with the DPPH method in triplicate.
Results: Results show that the extract has a high antioxidant capacity (EC ₅₀): 35.22 ± 0.33 μg.ml^-1, due to the presence of phenolic compounds (86.11 mg acid (GAE) / g extract ± 0.02), tannins (32.06 mg catechin (CE) / g extract ± 0:04) and flavonoids (44.85 mg quercetin (QUE) / g extract ± 0:09). The sun protection factor for concentrations of 0.01 to 0.09 μg.ml ^-1 was SPF ≥ 6.0. The extract therefore classifies as a potential sunscreen of natural origin.
Conclusion: The ethanolic extract of O. gratissimum has chemical components with therapeutic potential for its use as a sunscreen of natural origin. However, further studies are required to demonstrate its capacity to improve sunscreens of cosmetic formulation.

Key words: Ocimum gratissimum L., sun protection factor, sun protection.

INTRODUÇÃO

A busca por fitocosméticos a partir de compostos naturais para o tratamento de doenças na pele é uma das tendências promissoras do mercado consumidor mundial, que procura cada vez mais produtos que aproveitem os benefícios que a natureza proporciona, com qualidade científica, segurança e eficácia comprovada.^1-5

O câncer de pele é considerado um problema de saúde pública para o Brasil levando em consideração a sua grande abrangência epidemiológica, social e econômica.⁶ A exposição à radiação UV é um dos maiores fatores de risco que tem levado a um aumento dos casos destes tipos de câncer de pele, os quais são mais prevalentes em indivíduos de pele clara e nas regiões mais próximas do Equador.⁷

A localização geográfica do Brasil piora a situação, pois está entre os trópicos de Câncer e Capricórnio, sendo considerado um país tropical, no qual a incidência solar é maior, o ano inteiro e estima-se que sua composição é aproximadamente 50 % de infravermelho (IV), 5 % de ultravioleta (UV) e 45 % de luz visível (vis).⁸ Estes fatores somados à redução da camada de ozônio são um dos responsáveis pelo aumento de casos de câncer de pele no país.

O uso de protetores solares é a principal abordagem preventiva aos sinais do fotoenvelhecimento e do câncer de pele. Porém, alguns produtos comercializados atualmente, além de possuírem elevado preço de venda, podem desencadear reações adversas na pele como dermatites de contato, alergias e mutagenicidade, pelo uso de altas concentrações de filtros químicos que podem ter efeito fototóxico e risco à saúde dos consumidores.^9-13

O desenvolvimento de produtos mais eficientes, com altos fatores de proteção, menor quantidade de agentes sintéticos, menor potencial irritante e valores de mercado mais acessíveis tem despertado o interesse de muitos pesquisadores por cosméticos verdes.^1,14-21

A espécie botânica Ocimum gratissimum L. é uma planta pertencente à família Lamiaceae, representada por cerca de 7,500 espécies e agrupadas em 130 gêneros²² e popularmente conhecida como alfavaca, alfavação ou alfavaca-cravo. Botanicamente, classificada como um subarbusto aromático, ereto, com até 1 m de altura, folhas ovalado-lanceoladas, de bordos duplamente dentados, membranáceas, de 4 a 8 cm de comprimento e aroma forte. As flores são pequenas, roxo-pálidas, dispostas em racematos paniculados eretos e geralmente em grupos de três. O fruto é do tipo cápsula, pequeno, possuindo 4 sementes esféricas.²³

Na medicina popular, são inúmeras as propriedades terapêuticas descritas para O. gratissimum, que inclui o uso em banhos antigripais, paralisia, diuréticos, febrífugas, antiblenorrágicas, antifúngica, antioxidante, antibacteriana, antidiarréica, hipoglicemiante e anti-inflamatória.^22,24-31

Diante da preocupação da Organização Mundial da Saúde (OMS) com o aumento do número de pessoas com câncer de pele e da busca pela prevenção aos sinais de envelhecimento, essa pesquisa tem como objetivo investigar os constituintes fitoquímicos, atividade antioxidante e a ação fotoprotetora do extrato etanólico de O. gratissimum.

MÉTODOS

Material vegetal

A coleta foi realizada em março de 2013 em Imperatriz, Maranhão, região nordeste do Brasil. As folhas coletadas foram cuidadosamente separadas e encaminhadas ao Laboratório de Biotecnologia Ambiental (LABITEC). A espécie foi identificada pelo botânico Marcelo Francisco da Silva, Maranhão, MA, Brasil. Uma exsicata está depositada no Herbário da Universidade Estadual da Região Tocantina do Maranhão (UEMASUL), sob o número 008.2013.

Preparação do extrato etanólico

Para obtenção do extrato das partes aéreas de O. gratissimum foi utilizado o processo de maceração. O material botânico, após limpeza, secagem em estufa de ar circulante a 40 °C por 48 horas, foi triturado e pulverizado em moinho de facas elétrico (Tecnal, Modelo 680). Em seguida, 30 g do material vegetal foi submetido à maceração com álcool etílico na proporção de 5:1 (etanol/água) (v/v), permanecendo em contato por um período de quinze dias à temperatura ambiente e mantido ao abrigo da luz.

O extrato etanólico bruto (EEB) obtido, após filtração, foi concentrado à temperatura ambiente em evaporador rotativo e armazenado em frasco âmbar para posterior análise.

Investigação fitoquímica qualitativa preliminar

A triagem fitoquímica dos metabólitos secundários foi realizada no extrato etanólico bruto, segundo metodologias adaptadas de Barbosa et al.³² e Matos.³³ Os ensaios foram conduzidos para as seguintes classes químicas: cumarinas, terpenos, esteroides, alcaloides, taninos (inclusive taninos pirogálicos, taninos pirocatéquico, taninos gálicos), flavonoides e saponinas. A classificação dos grupos de metabólitos secundários foi realizada por meio de reações químicas que resultaram no desenvolvimento de cor e/ou formação de precipitado.

Avaliação da atividade antioxidante

Teor de fenólicos totais

A determinação do teor de fenólicos totais presentes no EBE foi realizada empregando o reagente de Folin-Dennis, com o ácido gálico como composto padrão de acordo com o método de Slinkard e Singleton³⁴, modificado por Almeida et al.³⁵ Neste ensaio foram utilizadas alíquotas de 0,5 mL dos extratos em diferentes concentrações, provenientes de uma solução estoque de 0,2 mg.mL^-1 em etanol P.A., foram misturadas a 2,5 mL de reagente Folin-Dennis, com agitação por 1 minuto. Em seguida, 2,0 mL de Na₂CO₃ (14 %) foram acrescentados à mistura e agitação por 1 minuto. Após 2 horas, a absorbância das amostras foi medida a 760 nm. O teor de fenólicos totais foi expresso como miligrama de equivalente de ácido gálico por grama de amostra (mg EAG/g), a partir da curva de calibração construída com o padrão de ácido gálico (0,02 a 200 μg.mL^-1) e todas as análises foram realizadas em triplicata.

Teor de flavonoides totais

O conteúdo de flavonoides totais foi determinado pelo método colorimétrico descrito por Dewanto et al.³⁶ e Meda et al.³⁷. Alíquotas de 2,0 mL de uma solução de AlCl ₃ a 2 % foram adicionadas a 2,0 mL de soluções de extratos etanólicos (0,4 mg.mL^-1 em etanol). Após 30 minutos de incubação, os valores de absorbância foram mensurados a 415 nm, empregando-se etanol como branco. O teor de flavonoides totais foi expresso como miligrama de equivalente de quercetina por grama de amostra (mg EQ/g), a partir da curva de calibração construída com o padrão quercetina (0,02 a 200 μg.mL ^-1). Todas as análises foram realizadas em triplicata.

Teor de taninos

Os taninos foram determinados utilizando o método descrito por Morrison et al. com modificações³⁸. Alíquotas de 0,1 mL do extrato foram adicionados 0,9 mL de metanol, 2,5 mL de solução de vanilina (0,065 mol/L em metanol) e 2,5 mL de uma solução de ácido clorídrico (2,25 mol/L em metanol). A solução foi aquecida e mantida a 60 °C durante 10 minutos, e a absorbância foi determinada a 500 nm. O teor total de tanino foi expresso em miligramas de equivalentes de catequina (CE) por grama de amostra (mg CE/g), a partir da curva de calibração construída com o padrão de catequina (0,01 a 300 μg.mL ^-1). Todas as análises foram realizadas em triplicata.

Atividade sequestradora do radical DPPH

A atividade antioxidante foi baseada no método de redução do radical 2,2'-difenil-1-picrihidrazilo (DPPH.). Os resultados foram expressos como EC₅₀, que é a quantidade de antioxidantes necessária para diminuir em 50 % a concentração inicial de DPPH da solução. Dessa forma, quanto menor o valor do EC ₅₀, menor terá sido o valor do extrato utilizado para reduzir o radical DPPH• e maior a sua atividade antioxidante.^39-43

A absorbância do radical DPPH foi determinada em 517 nm em espectrofotômetro Femton 800 XI. Em 1,5 mL de radical DPPH a 6x10 ^-5 μmol.L^-1 foram dissolvidos em metanol puro, adicionada 0,5 mL das soluções contendo diferentes concentrações de cada extrato ou do controle positivo (quercetina) nas concentrações de 0,01 a 0,25 mg.mL^-1 e em seguida realizada a homogeneização e depois armazenada à temperatura ambiente. Após um período de 30 minutos, foram realizadas as leituras das absorbâncias das amostras e do branco (MeOH + DPPH) em intervalos de 5 minutos, determinando a curva cinética da reação. Todas as análises foram realizadas em triplicata. A atividade sequestradora de radicais livres pelas amostras (AS %) dos extratos nas diferentes concentrações foram calculadas pela equação 1:

Onde A_DPPH é a medida da absorbância inicial da solução de DPPH, e A é a absorbância da mistura reacional (solução etanólica dos extratos nas diferentes concentrações e solução de DPPH) no tempo de 60 minutos.

Os ensaios foram realizados em triplicata e os resultados obtidos foram analisados no programa estatístico Origin 7.0. Neste programa as regressões lineares dos extratos foram obtidas de acordo com as suas diferentes concentrações em função dos percentuais de atividade sequestradora de radicais (AS%). Na equação da reta: y = a + bx, y representa 50 % do sequestro do radical livre DPPH e x é a concentração da amostra que sequestra 50 %, ou seja, a concentração eficiente (EC₅₀) das amostras analisadas. Os valores de EC₅₀ foram expressos como média ± erro padrão.

Avaliação da atividade fotoprotetora

A atividade fotoprotetora foi avaliada in vitro através da determinação do comprimento de onda máximo (λ_máximo.) e da absorbância máxima (A _máxima.). Os extratos secos foram diluídos em álcool etílico PA (Merck) (0,01 a 0,1 µg.mL^-1 p/v) e realizada varredura entre os comprimentos de onda de 260 a 400 nm (Espectrofotômetro FEMTO, modelo 800XI, em cubeta de quartzo de 1,0 cm caminho óptico), para verificar a absorção nas regiões ultravioleta A e B (UVA e UVB). O álcool etílico absoluto PA foi utilizado como branco e o experimento realizado em triplicata.

Cálculo do Fator de Proteção Solar (FPS)

Os cálculos foram realizados considerando os intervalos de comprimento de onda (λ) determinados por Mansur et al.^{44, 45} Os valores do efeito eritemogênico da radiação - EE (λ) e intensidade do sol - I (λ) utilizados para o cálculo do FPS foram os mesmos usados na literatura, empregando a equação 2:

Onde: FC = fator de correção (10), referente a um FPS = 4; EE (λ) = efeito eritemogênico da radiação; I (λ) = intensidade do sol; abs (λ) = leitura espectrofotométrica da absorbância do extrato etanólico de avelós.

Os resultados foram expressos na forma de média ± desvio padrão (n = 10). Para análise dos dados gerados pelo experimento realizado, foi utilizado o software estatístico SPSS versão 17.0.

RESULTADOS

A caracterização qualitativa dos principais constituintes químicos da espécie vegetal em estudo foi realizada através de reações químicas cromogênicas ou de precipitação. Os resultados da prospecção fitoquímica do extrato etanólico bruto (EEB) das partes aéreas de O. gratissimum são apresentados na Tabela 1. Estes resultados indicaram a presença de açúcares redutores, alcaloides, antraquinonas, compostos fenólicos, flavonóides, taninos, saponinas, esteroides e triterpenóides.

As determinações dos teores de compostos fenólicos, flavonóides e taninos totais no EEB de O. gratissimum são mostradas na Tabela 2.

A atividade fotoprotetora do EEB foi avaliada in vitro pelo método Mansur^44,45, por ser eficaz e rápido, além de ter uma boa correlação com resultados encontrados in vivo^46,47. Os resultados para o cálculo do FPS do EEB de alfavaca, em diferentes concentrações, são apresentados na Tabela 3.

O extrato etanólico bruto das folhas de O. gratissimum apresentou valores de proteção solar (FPS) variando de 6,0 a 23,98 nas concentrações testadas, sugerindo possível aplicação para fins terapêuticos em preparações dermatológicas.

DISCUSSÃO

As pesquisas científicas para descobertas de novos princípios ativos tendem para a utilização de plantas, que possuam compostos fenólicos em sa estrutura, pois são dotadas de ação antioxidante e possível ação fotoprotetora.^9,48

A prospecção fitoquímica do extrato etanólico (EEB) das folhas de O. gratissimum identificou a presença de fenóis, taninos e flavonóides, que sugere elevado potencial antioxidante, principalmente, por atuarem como sequestradores de radicais de oxigênio.⁴⁹ Segundo Carvalho et al.⁹ e Souza et al.², as substâncias ativas presentes nos vegetais que podem ser empregadas a fim de proporcionar uma fotoproteção cutânea mais ampla à formulação, são os antioxidantes como as vitaminas C e E, os taninos, alcaloides e flavonoides.

A atividade antioxidade é um ponto importante no estudo de fotoproteção, sendo determinada por vários métodos colorimétricos. O método do DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil), é um dos mais utilizados por ser rápido, prático e seguro.^49,50 (O extrato EEB apresentou capacidade antioxidante (EC ₅₀) de 35,22 ± 0,33 μg.mL^-1, enquanto o controle positivo quercetina (3,5,7,3',4'-pentahidroxi flavona) foi de 0,93 ± 0,35 μg.mL^-1. Os resultados encontram-se abaixo dos descrito por Campos et al.⁵¹, que considera os extratos botânicos ativos quando apresentam EC₅₀ < 500 μg.mL ^-1.

A atividade sequestradora de radicais livres para o EEB pode ser explicada pela presença de compostos fenólicos (86,11 mg de GAE/g extrato ± 0.02), taninos (32,06 mg de CE/g extrato ± 0,04) e flavonoides (44,85 mg de QUE/g extrato ± 0,09), um valor considerado alto quando comparado com outras espécies botânicas descritas na literatura.

O FPS in vitro foi determinado pelo método espectrofotométrico desenvolvido por Mansur^44,45, usando a região UVB. É uma metodologia que correlaciona testes in vivo, relacionando a absorbância com o efeito eritematógeno UVB e a intensidade da luz em comprimentos de onda de 290-320 nm.⁵² Os dados sugerem que os efeitos fotoprotetorores dos extratos ocorrem de forma concentração dependentes, ou seja, quanto maior a concentração dos extratos em solução, maior será o FPS e, consequentemente, a atividade fotoprotetora. ⁵²

De acordo com a legislação brasileira, RDC nº 30 de 01 de junho de 2012¹¹, apenas FPS maior ou igual a 6 pode ser considerado como produtos cosméticos com atividade fotoprotetora UVB. O extrato EEB das folhas de O. gratissimum nas concentrações de 0,01 a 0,09 μg.mL^-1, tiveram atividades fotoprotetoras satisfatórias (6,0 a 23,98, respectivamente) e acima do limite mínimo exigido pela ANVISA.

Os resultados obtidos nessa pesquisa são melhores que outros encontrados na literatura. Em estudos realizados por Rosa et al.⁴⁷ utilizando o mesmo método, foram encontrados FPS 8 para mil-folhas (Achillea millefolium L.), 6 para repolho (Brassica oleracea var. capitata L.),5 para tiririca (Cyperus rotundus L.), 5 para boldo-brasileiro (Plectranthus barbatus Andr.), 2 para arnica paulista (Porophyllum ruderale (Jacq.) Cass.) e 1 para serralha (Sonchus oleraceus L.).

Com isso, este estudo demonstrou o potencial antioxidante e fotoprotetor do extrato etanólico bruto das folhas de O. gratissimum. Estudos complementares devem ser realizados para comprovação e eficiência da atividade fotoprotetora, tendo como perspectiva a sua utilização como princípio ativo para formulações fitocosméticas inovadoras.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Prof. Marcelo Francisco da Silva pela identificação e caracterização da espécie vegetal.

Conflicto de intereses

Los autores plantean que no tienen conflicto de intereses.

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Recibido: 16/03/2017
Aprobado: 26/06/2018

José Fábio França Orlanda. Universidade Estadual da Região Tocantina do Maranhão, Brasil. Correo electrónico: josefabio@uemasul.edu.br