ARTÍCULO ORIGINAL

Actividad antibacteriana in vitro de los extractos y de las tinturas al 20 % de Macroptilium lathyroides (L.) Urban (maribari)

In vitro antibacterial activity of extracts and 20 % tinctures of Macroptilium lathyroides (L.) Urban (phasey bean)

Josefa de la Trinidad López Fuentes,^I Dilver Peña Fuentes,^II, Gleysin Cabrera Herrera^III

^I Facultad de Ciencias Informáticas Naturales y Exactas. Universidad de Granma, Cuba.
^II Centro de Estudio de Química Aplicada. Universidad de Granma, Cuba.
^III Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. La Habana. Cuba.

RESUMEN

Introducción: Macroptilium lathyroides (L.) Urban es una planta herbácea de amplia distribución, especialmente abundante en los terrenos arenosos. En la medicina popular se utiliza como antipirético, aunque en la práctica aún no se han realizado estudios antimicrobianos sobre esta especie.
Objetivo: Evaluar la actividad antibacteriana in vitro de los extractos y las tinturas al 20 % obtenidos de los distintos órganos de Macroptilium lathyroides frente a diferentes cepas de microorganismos patógenos.
Métodos: Se obtuvieron los extractos etéreos, etanólicos y acuosos, así como las tinturas al 20 % de las hojas, los tallos y las raíces de Macroptilium lathyroides mediante la extracción asistida por ultrasonido. Se determinó la actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 según el método de difusión en agar por diseminación superficial en disco (Bauer-Kirby). Los grupos de metabolitos secundarios responsables de la actividad antibacteriana se determinaron con espectroscopia ultravioleta visible.
Resultados: Los extractos etéreos y etanólicos, así como las tinturas al 20 % de M. lathyroides mostraron actividad contra las cepas de Staphylococcus aureus ATCC 29213 y Escherichia coli ATCC 25922; sin embargo, no se detectó actividad contra Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Los extractos acuosos no mostraron ninguna actividad contra las cepas evaluadas. La espectroscopia UV-vis de los extractos con los mejores resultados indica que los alcaloides y las cumarinas son los metabolitos secundarios responsables de la actividad antibacteriana.
Conclusiones: Los extractos etéreos y etanólicos, así como las tinturas al 20% de M. lathyroides presentan actividad contra bacterias grampositivas y gramnegativas, y los alcaloides y las cumarinas son los grupos de metabolitos secundarios responsables de la actividad antibacteriana.

Palabras claves: Macroptilium lathyroides; actividad antibacteriana; alcaloides; cumarinas.

ABSTRACT

Introduction: Macroptilium lathyroides (L.) Urban is a herbaceous plant of wide distribution particularly abundant in sandy soils. The species is used in folk medicine as antipyretic, but no studies have been conducted about its antimicrobial properties.
Objective: Evaluate the in vitro antibacterial activity of extracts and 20% tinctures from the various parts of the plant species Macroptilium lathyroides against different strains of pathogenic microorganisms.
Methods: Ethereal, ethanolic and aqueous extracts, as well as 20% tinctures, were obtained from Macroptilium lathyroides leaves, stems and roots by ultrasound-assisted extraction. Determination of antibacterial activity against Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 was based on disk diffusion antibiotic sensitivity testing (Kirby-Bauer). The groups of secondary metabolites responsible for antibacterial activity were determined by ultraviolet-visible spectroscopy.
Results: The ethereal and ethanolic extracts, as well as the 20% tinctures of M. lathyroides, displayed activity against Staphylococcus aureus ATCC 29213 and Escherichia coli ATCC 25922 strains. However, no activity was detected against Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. The aqueous extracts did not have any effect on the strains evaluated. UV-Vis spectroscopy of the most effective extracts revealed that alkaloids and coumarins are the secondary metabolites responsible for antibacterial activity.
Conclusions: Ethereal and ethanolic extracts, as well as 20% tinctures of M. lathyroides displayed activity against gram-positive and gram-negative bacteria. Alkaloids and coumarins are the groups of secondary metabolites responsible for such antibacterial activity.

Key words: Macroptilium lathyroides, antibacterial activity, alkaloids, coumarins.

INTRODUCCIÓN

Macroptilium lathyroides (L.) Urban es una planta herbácea de amplia distribución, presente en los terrenos yermos y cultivados, así como en colinas de poca y mediana elevación. Se encuentra especialmente en terrenos arenosos, donde se considera a veces una mala hierba. En la medicina popular, específicamente en Camagüey, Cuba, se utiliza para combatir la fiebre.¹ A pesar del uso que se le da a esta planta, se han publicado muy pocos estudios relacionados con su composición fitoquímica y prácticamente no se han realizado estudios para comprobar las potencialidades antimicrobianas de los metabolitos secundarios de esta especie.

Entre las principales familias de metabolitos secundarios presentes en M. lathyroides se han descrito los alcaloides y las cumarinas,² y se ha tenido en cuenta la actividad antimicrobiana informada para estos grupos de compuestos orgánicos,^3-4 así como el uso etnobotánico de esta planta. En este trabajo se evalúa la actividad antibacteriana in vitro de los extractos y las tinturas al 20 % obtenidos de los distintos órganos de Macroptilium lathyroides frente a diferentes cepas de microorganismos patógenos de interés clínico.

MÉTODOS

Recolección e identificación del material vegetal

La planta M. lathyroides fue recolectada el 27 de enero del 2014 en el reparto de Caymari, municipio Manzanillo, provincia de Granma, Cuba, a las 8:00 am a temperatura de 26 °C. Su caracterización y certificación fue confirmada en el Jardín Botánico CUPAYNICÚ del municipio Guiza por el Dr.C. Luis Catasús Guerra y la planta se registró con el número 3034 en el herbario Catasús.⁵

Desinfección, secado y pulverizado del material vegetal

El material vegetal se clasificó para eliminar las partes que no reunían las condiciones óptimas para el estudio según la NRSP 309 del Ministerio de Salud Pública de Cuba (MINSAP).⁶ El material se lavó con agua potable para su desinfección y posteriormente se sumergió en una disolución de hipoclorito de sodio al 2 %. Las hojas, los tallos y las raíces se secaron por separado sobre planchas de cartón perforadas durante una semana a la sombra, el material se removió dos veces al día y el secado se completó en una estufa (WSU 400, Alemania) con circulación de aire a 40 °C durante 2 días. Finalmente se pulverizó la droga seca con un molino eléctrico (IKA basic con cabezal de molienda MF10.1, Alemania), para obtener un tamaño de partícula de 2,0 mm.

Obtención de los extractos etéreos, etanólicos y acuosos

Se pesaron 14 g del material vegetal pulverizado en una balanza técnica (BS 2202S SARTORIUS, Alemania) y se realizaron las extracciones sucesivas con 100 mL de solvente de polaridad creciente (éter dietílico, etanol y agua) para lograr un mayor agotamiento de la droga en el material vegetal seco mediante el método de extracción asistida por ultrasonido (baño ultrasónico SB-3200 DTD, China) a una frecuencia 40 KHz y una temperatura de 25 °C durante 2 h.

Preparación de las tinturas al 20 % y los extractos secos

A 40 g de la droga cruda, seca y molida del tallo, las hojas y las raíces se le añadió una solución hidroetanólica al 70 % (v/v) como disolvente (200 mL). La extracción se realizó en un baño ultrasónico (SB-3200 DTD, China) a una frecuencia de 40 KHz y temperatura de 22 °C durante 2 h. La tintura obtenida se filtró y el filtrado se almacenó en frascos de color ámbar a temperatura de 4 °C.

Los extractos secos se obtuvieron por rotoevaporación del disolvente de las tinturas a 40 °C en un rotoevaporador IKA RV Basic 10.1 conectado a una bomba de vacío Vaccubrand PC 3001 VARIO^pro. Los extractos secos se almacenaron a 4 °C hasta su utilización.

Microorganismos

Para evaluar la actividad antibacteriana se emplearon cepas de Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC 25922) y Staphylococcus aureus (ATCC 29213) aisladas en agar nutritivo marca Difco^TM preparado según las especificaciones del proveedor y esterilizadas en autoclave a 121 °C y a 1 atmósfera durante 20 min. El procedimiento se realizó mediante la técnica de agotamiento de la muestra por estría en las placas de Petri servidas con un espesor de agar de 25 a 30 mL e incubadas durante 18 a 24 h a 37 °C. Después de la incubación se tomaron de 2 a 5 colonias de formas similares con ayuda de un escobillón estéril y se suspendieron las bacterias en una disolución de NaCl al 0,85 % hasta alcanzar una turbidez cualitativamente comparable con el patrón 0.5 de Mcfarland.

Evaluación de la actividad antibacteriana

La evaluación de la actividad antibacteriana se realizó mediante el método de difusión en agar por diseminación superficial en disco de Bauer-Kirby⁷ adoptado por el "Clinical and Laboratory Standards Institute" (CLSI)⁸ con algunas modificaciones. Los discos de papel de filtro de seis milímetros de diámetro se sumergieron en los extractos etéreos, etanólicos y acuosos, así como en las tinturas al 20 % de las hojas, de los tallos y de las raíces de M. lathyroides. Para determinar la actividad antibacteriana de los extractos secos se suspendió 0,5 g del extracto en 1 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) para una concentración final de 500 μg/mL y se aplicaron 7,2 μL en discos de papel de filtro para una concentración final de 3 600 μg/disco. Para terminar, las placas de Petri se incubaron a 37 ± 0,1 °C durante 24 h en una incubadora Boxun BG-80, China. Las zonas de inhibición del crecimiento del microorganismo alrededor de los discos se midieron en milímetros.

Cada tratamiento tuvo tres repeticiones. Se utilizaron como controles negativos discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro cargados con 5 μL de DMSO y como controles positivos, discos de los antibióticos comerciales de Gentamicina y Ciprofloxacino con 30 y 5 µg/disco, respectivamente (Sensi-DiscTM, Francia). Los resultados se declararon como el promedio del diámetro de los halos de inhibición para cada tratamiento.

Espectroscopia UV-vis

Se realizó la espectroscopia UV-vis de los extractos secos de los tallos, de las hojas y de las raíces de M. lathyroides utilizando un espectrofotómetro UV-Visible (UV-2100 Rayleigh, China) de dos haces y cubetas de cuarzo con tapa de 1 cm de recorrido óptico. Para ello se disolvió el extracto seco (50 mg) en etanol al 90 % (2 mL). El equipo se calibró con el solvente de la muestra y se realizó un barrido en el espectro UV-vis entre 190 y 900 nm. Los espectrogramas fueron procesados con el software UV21 00 Aplication (Rayleigh, China).

RESULTADOS

En la evaluación inicial de la actividad antimicrobiana in vitro de los extractos etéreos, etanólicos y acuosos de las hojas, los tallos y las raíces de M. lathyroides no se detectó actividad contra P. aeruginosa para ninguno de los extractos evaluados. Los extractos acuosos, por su parte, no resultaron activos frente a ninguna de las cepas de bacterias empleadas. Sin embargo, los extractos etéreos y etanólicos de todos los órganos de la planta mostraron actividad frente a S. aureus y E. coli (tabla 1).

Tal como se esperaba, debido a la similitud entre la composición de los extractos etanólicos y las tinturas al 20 %, estas mostraron actividad frente a S. aureus y E. coli e inhibieron su crecimiento, pero se mostraron inactivas frente a P. aeruginosa (tabla 2). Los halos de inhibición de las tinturas fueron similares a los obtenidos para los extractos etanólicos. Por su parte, los extractos secos mostraron los mejores resultados de actividad antibacteriana. Los mayores halos de inhibición (11 mm) se obtuvieron para los extractos preparados a partir de las hojas y las raíces (tabla 2).

Se realizó la espectroscopia UV-vis de los extractos con los mejores resultados de actividad biológica para los extractos secos de hojas, tallos y raíces de M. lathyroides. El espectro del extracto seco del tallo mostró máximos de absorción a longitudes de onda de 375, 384, 386, 390 y 392 nm, que evidencian la presencia de cumarinas. También se detectó un máximo de absorción a 207 nm, que sugiere la presencia de alcaloides (Fig. 1).

En el extracto seco de las hojas de M. lathyroides se encontraron importantes máximos de absorción en el espectro UV-vis entre 413-430 nm, propios de las cumarinas (Fig. 2). Por su parte, el espectro UV-vis del extracto seco de las raíces de M. lathyroides muestra importantes máximos de absorción alrededor de 200 nm, así como máximos de absorción entre 370-380 nm, lo que evidencia la presencia de alcaloides y cumarinas, respectivamente (Fig. 3).

DISCUSIÓN

La actividad antibacteriana mostrada por los extractos y las tinturas al 20 % de M. lathyroides están en correspondencia con los resultados publicados en el 2013 por De Sousa y otros, quienes describieron que los extractos hexánicos de las hojas y los tallos, así como un extracto de las raíces de M. lathyroides, obtenido en acetato de etilo, presentan actividad frente a S. aureus y E. coli, no así frente a P. aeruginosa.⁹

La actividad antibacteriana detectada para los extractos y las tinturas al 20 % de M. lathyroides se debe, probablemente, al sinergismo entre los grupos de metabolitos secundarios más abundantes informados para esta especie. En un trabajo anterior se reportó que los extractos etéreos y etanólicos, así como las tinturas al 20 % preparados a partir de esta planta son ricos en alcaloides y cumarinas.²

Varios autores han demostrado la actividad antimicrobiana de los extractos de plantas ricos en cumarinas o de los compuestos puros pertenecientes a esta familia orgánica.^10-13 Por otra parte, los alcaloides también constituyen un grupo importante de metabolitos secundarios con demostradas propiedades antimicrobianas.^14-17

Llama la atención que los extractos acuosos no mostraron actividad antibacteriana frente a ninguna de las cepas evaluadas. Un estudio de la composición fitoquímica de esta planta realizado anteriormente reveló la presencia de alcaloides en el extracto acuoso y la ausencia de cumarinas.² La falta de actividad de los extractos acuosos de M. lathyroides pudiera deberse a que la actividad antibacteriana causa sinergismo entre las cumarinas y los alcaloides, o a que los alcaloides más polares presentes en los extractos acuosos no son activos contra los microorganismos evaluados.

Los extractos secos mostraron los mejores halos de inhibición, lo cual se debe al aumento de la concentración de los principios activos. Esto explica la estabilidad de los principios activos en condiciones de rotoevaporación, hecho importante a tener en cuenta para el futuro aislamiento de los compuestos responsables de la actividad antimicrobiana.

Con el objetivo de corroborar la composición fitoquímica informada para M. lathyroides² y de identificar los grupos de metabolitos secundarios responsables de la actividad antimicrobiana detectada, se realizó la espectroscopia UV-vis de los extractos con los mejores resultados de actividad biológica.

El espectro UV-vis del extracto seco del tallo mostró máximos de absorción a longitudes de onda entre 375 y 392 nm que evidencian la presencia de cumarinas, las cuales presentan absorción bien definida entre 370 y 450 nm en dependencia del patrón de sustitución y de los efectos estéricos asociados.¹⁸ Los máximos de absorción en la banda del espectro comprendida entre 413-430 nm fueron detectados para el extracto seco de las hojas, así como entre 370 y 380 nm para el extracto seco de la raíz, los que indica la presencia de cumarinas y corroboran los resultados de la composición fitoquímica de esta planta.²

También se detectó un máximo de absorción a 207 nm en el extracto seco del tallo, así como importantes máximos de absorción alrededor de 200 nm para el extracto seco de las raíces. Estos resultados corresponden a transiciones n-σ*, característica de los compuestos con heteroátomos (O, N, S) en los cuales los grupos aminos provocan una absorción final λ _máx< 220 nm. Estos picos indican, además, la presencia de compuestos con grupos aminos alifáticos o de heteroátomos que contienen N en su estructura, propio de los alcaloides.¹⁹

Los resultados de este trabajo, junto con los informes anteriores acerca de la composición fitoquímica de la planta en estudio, apuntan a que la actividad antimicrobiana de los extractos de M. lathyroides está determinada, fundamentalmente, por la presencia de alcaloides y cumarinas capaces de inhibir la replicación de los microorganismos o por el efecto sinérgico entre los compuestos pertenecientes a estas dos familias de metabolitos secundarios.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Servicio Alemán de Intercambio Académico (DAAD) por el apoyo con el equipamiento de laboratorio.

Conflicto de intereses

Los autores plantean que no tienen conflicto de intereses.

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Recibido: 16 de marzo de 2017.
Aprobado: 30 de enero de 2018.

Dilver Peña Fuentes. Centro de Estudio de Química Aplicada. Facultad de Ciencias Informáticas Naturales y Exactas, Universidad de Granma, Cuba.
Correo electrónico: dilver@udg.co.cu