Atividade antibacteriana e moduladora in vitro de extrato metanólico e hexânico de beta vulgaris spp. (Linnaeus)

Saulo Relison Tintino; Maria Aline Ferreira Sobra; Raul de Sousa Andreza; Erivania Ferreira Alves; Ana Jessica Furtado Cruz; Amanda Talita Lopes de Sousa; Cícera Datiane de Morais Oliveira; Lívia Maria Garcia Leandro; Pedro Everson Alexandre de Aquino; Luciene Ferreira de Lima

Atividade antibacteriana e moduladora in vitro de extrato metanólico e hexânico de beta vulgaris spp. (Linnaeus)

ARTÍCULO ORIGINAL

Atividade antibacteriana e moduladora in vitro de extrato metanólico e hexânico de beta vulgaris spp. (Linnaeus)

Actividad antibacteriana y modulación in vitro de extractos de metanol y hexano del beta vulgaris spp. (Linnaeus)

Antibacterial activity and modulatory in vitro methanol and ethanol extracts of beta vulgaris spp. (Linnaeus)

Maria Aline Ferreira Sobral,^IRaul de Sousa Andreza,^I Erivania Ferreira Alves,^I Ana Jessica Furtado Cruz,^I Amanda Talita Lopes de Sousa,^ICícera Datiane de Morais Oliveira,^IISaulo Relison Tintino,^IILívia Maria Garcia Leandro,^IPedro Everson Alexandre de Aquino,^IIILuciene Ferreira de Lima^II

^I Faculdade Leão Sampaio. Brasil.
^II Universidade Regional do Cariri (URCA). Brasil.
^III Universidade Federal do Ceará. Brasil.

RESUMO

Introdução: Beta vulgaris spp. conhecida popularmente como beterraba é bastante utilizada, além do consumo alimentar, de maneira etnofarmacológica para o combate de diversas infecções como: dores no trato gastrointestinal, inflamações crônicas, lesões nas genitais, inflamações nos ovários, cólicas, problemas renais, problemas cardíacos e diabetes.
Objetivo: avaliar a atividade antibacteriana e modulatória dos extratos metanólicos e hexânicos dos frutos de B. vulgaris frente a cepas bacterianas padrões e multirresistentes, além de determinar as principais classes de metabólitos secundários.
Métodos: os extratos metanólicos e hexânicos de B. vulgaris foram analisados para a atividade antibacteriana por meio de teste de microdiluição em caldo para determinação de Concentração Inibitória Mínima e modulação de aminoglicosídeos a gentamicina e amicacina.
Resultados: às cepas de Staphylococcus aureus e Escherichia coli diminuiram a Concentração Inibitória Mínima de 64 µg/mL and 256 µg/mL quando combinadas aos antibióticos e extratos, Apresentando, portanto um efeito de aumento da atividade antibiótica, com exceção para o extrato hexânico em associação com a gentamicina contra cepas multirresistentes de Staphylococcus aureus.
Conclusão: na prospecção fitoquímica foram evidenciados a presença de vários metabólitos secundários, o que pode explicar a ação bactericida desta planta. Portanto, diante dos resultados, B.vulgaris é uma fonte promissora no combate a resistência bacteriana.

Palavras chave: atividade antibacteriana; Beta vulgaris spp; modulação; microrganismos patogênicos.

RESUMEN

Introducción: Beta vulgaris SSP. conocido em lo popular como remolacha, es muy utilizado, además como consumo de alimentos, de manera etnofarmacológica para combatir varias infecciones como: dolores en el tracto gastrointestinal, inflamaciones crónicas, lesiones genitales, inflamaciones en ovarios, cólicos, problemas renales, diabetes y problemas del corazón.
Objetivo: evaluar la actividad anti-bacteriana y moduladora de extractos metanólicos y hexânicos del fruto de B. vulgaris frente de cepas bacterianas multirresistentes estándares y además de determinar los principales metabolitos secundarios.
Métodos: los extractos metanólicos y hexânicos de B. vulgaris fueron analizados para la actividad antibacteriana mediante prueba de microdilución en caldo para la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria y la modulación de aminoglicósidos gentamicina y amikacina.
Resultados: las cepas de Staphylococcus aureus y Escherichia coli disminuyeron la Concentración Mínima Inhibitoria de 64 µ g/mL y 256 µ g/mL al combinarlos con antibióticos y los extractos, mostrando así un aumento de la actividad antibiótica. Excepto el extracto hexânico en combinación con la gentamicina contra cepas multirresistentes de Staphylococcus aureus. La fitoquímica evidencia la presencia de varios metabolitos secundarios que pueden explicar la acción bactericida de esta planta.
Conclusión: los resultados de B. vulgaris muestran que es una fuente prometedora en la lucha contra la resistencia bacteriana.

Palabras clave: actividad antibacteriana; Beta vulgaris spp; modulación; Microorganismos patógenos.

ABSTRACT

Introduction: Beta vulgaris spp. is popularly known as beets, widely used in ethno pharmacological way to fight various infections of the gastrointestinal tract such as pain, chronic inflammation, and sores on the genitals, inflammation of the ovaries, cramps, kidney problems, heart problems and diabetes.
Objective: to evaluate the antibacterial and modulatory activity of methanol extracts of fruits and hexanic of B. vulgaris against strains of multiresistant bacterial and standards. In addition, to determining the major classes of secondary metabolites such as flavonoids and tannins.
Methods: Hexane and methanol extracts of B. vulgaris were analyzed to antibacterial activity by the broth microdilution test for determination of Minimum Inhibitory Concentration and modulation and aminoglycosides such as amikacin, gentamicin.
Results: the strains relevant of Escherichia coli and Staphylococcos aureus decreased Minimum Inhibitory Concentration of 64 mg/mL and 256 mg/mL thereof when combined antibiotic and extracts. Showing, so a enhancement effect of antibiotic activity, except for the hexane extract in combination with gentamicin against multidrug-resistant strains of Staphylococcus aureus.
Conclusion: in phytochemical were shown the presence of various secondary metabolites, which may explain the bactericidal action of this plant. Therefore, given the results, B. vulgaris spp. is a promising source in combat bacterial resistance.

Keywords: Antibacterial activity; B. vulgaris spp; Modulation; Pathogenic microorganisms.

INTRODUÇÃO

As plantas medicinais têm sido usadas pela população desde a antiguidade como forma de aliviar ou até curar enfermidades.¹A maioria das pessoas que usam plantas medicinais acredita que estes são extremamente seguros, somente pelo fato de serem naturais. Isso explica a importância de estudos multidisciplinares envolvendo extratos e óleos essenciais de plantas com propriedades químicas e farmacológicas desconhecidas, para que assim amplie o conhecimento de como agem, quais seus efeitos tóxicos e colaterais.²Com isso, os metabólitos secundários vegetais apresentam grande valor socioeconômico. As substâncias antimicrobianas de plantas são detectadas, principalmente, por meio da sua capacidade de inibir o crescimento de microrganismos.³

Beta vulgaris spp é popularmente conhecida como beterraba, pertencente à família Chenopodiaceae uma hortaliça muito nutritiva, possui forte apelo sensorial, devido à sua cor vermelho-intensa, cor essa que é decorrente da presença das betacianinas são pigmentos vermelhos que, juntamente com as betaxantinas, de coloração amarela, pertencem ao grupo das betalaínas.⁴É bastante utilizada também na formação de esmalte dos dentes, aumenta a resistência dos vasos sanguíneos e auxilia na regulação do trato intestinal, diabetes, gota, hemorroidas e diversas infecções.⁵

Entre os últimos anos a microbiologia vem crescendo quanto ao estudo dos microrganismos patogênicos multirresistentes, em decorrência desse aumento de resistência bacteriana é que é ocasionada a busca de substancias com caráter antimicrobiano.⁶

Entre as diversas classes de antibióticos, os aminoglicosídeos, são as classes que mais sofre ação de resistência microbiana. Sendo assim, os principais meios de resistências à concentração utilizada do antibiótico, alterações mutagênicas ou estruturais nas enzimas.⁷Em relação ao crescimento da resistência dos microrganismos patogênicos, é visto que é preciso a utilização de substancias antimicrobiana mais eficiente e que tragam benefícios aos respectivos pacientes e que ao mesmo tempo não apresente toxicidade.⁸

Nessa perspectiva, esse estudo se propôs a avaliar, in vitro, a atividade antibacteriana e moduladora de extratos metanólico e hexânico dos frutos de B. vulgaris frente a cepas de bactérias: Staphylococcus aureus, Escherichia coli e multirresistentes de Staphylococcus aureus e Escherichia coli de linhagem padrão e multirresistente. Avaliou-se também qualitativamente a presença de metabólitos secundários presentes nestes.

MÉTODOS

Material vegetal

Os frutos de B. vulgaris sp foram coletadas nas feiras livres no período de Agosto de 2014, no município de Barbalha, Ceará-Brasil.

Material bacteriano

Os microrganismos utilizados nos testes foram obtidos através do Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular (LMBM) da Universidade Regional do Cariri (URCA). Foram utilizadas linhagens padrão de bactérias Escherichia coli ATCC 10536; Staphylococcus aureus ATCC 25923 e multirresistentes da espécie Escherichia coli EC27 e Staphylococcus aureus 358. Com o perfil de resistência indicado na tabela 1. As bactérias multirresistentes são provenientes de ferida cirúrgica e ambas possuem resistência, a S. aureus 358 possui resistência a antibióticos nominados oxacilina, gentamicina, tobramicina, amicacina, cefalexina, neomicina, paramomicina, butirosine, sisomicina, netilmicina. A E. coli27 é resistente a azitromicina, amoxacilina, ampicilina, amicacina, amoxilina, cefalexina, cefaclor, cefalotina, ceftazinidima, ciprofloxacino, clorafenicol, imipenem, canamicina, sulfametoxazol, tetraciclina, tobramicina. Antes dos ensaios, as linhagens foram cultivadas a 37 °C por 24 h em Brain Heart Infusion – BHI (DifcoLaboratoriesLtda).

Preparação dos extratos metanólico e hexânico

Para preparação dos extratos foram coletadas as frutas que foram picadas e permaneceram submersas em metanol e hexano separadamente por 72 h. Após esse período, o eluente foi filtrado em papel filtro para separação dos resíduos sólidos e concentrado em condensador rotativo a vácuo e banho-maria (model Q-214M2 – Quimis, Brazil),⁹obtendo-se rendimentos dos extratos apresentados. Para os testes foram utilizadas soluções preparadas a partir dos extratos sob uma concentração de 10 mg/mL, dissolvidos em DMSO (dimetil sulfóxido), em seguida diluídos com água destilada para uma concentração de 1024 μg/mL.

Teste de atividade antibacteriana

A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi determinada em ensaio de microdiluição em caldo¹⁰utilizando-se um inóculo de 100 μL de cada linhagem (padrão), suspensas em caldo BHI que apresentava uma concentração de 10⁵ UFC/mL em placas de microtitulação com 96 poços, com diluições em série ½. Em cada poço foi adicionado 100μL de solução de cada extrato. As concentrações finais dos extratos variaram entre 512 – 8 μg/mL. Para os controles foram utilizados os antibióticos padrões amicacina, gentamicina (Sigma) cujas concentrações finais variaram entre 512 μg/mL – 8,0 μg/mL. As CIMs foram registradas como as menores concentrações para a inibição do crescimento. Após 24 h na estufa a 37 °C, preparou-se uma solução indicadora de resazurina sódica (Sigma) em água destilada estéril na concentração de 0,01 % (p/v), sendo que 20 µL da solução indicadora foram adicionados em cada cavidade e as placas ficaram num período de incubação de 1 h em temperatura ambiente. A mudança de coloração azul para rosa, devido à redução da resazurina, indica o crescimento bacteriano,¹⁰auxiliando a visualização da CIM, definida como a menor concentração capaz de inibir o crescimento microbiano, evidenciado pela cor azul inalterada.

Modulação com os antibióticos

Os extratos foram misturados em caldo BHI 10 % em concentrações subinibitórias, obtidos e determinados após a realização de teste de avaliação da CIM, sendo que para o teste de modulação a concentração da solução de extrato foi reduzida 8 (oito) vezes(CIM/8). A preparação das soluções de antibióticos foi realizada com a adição de água destilada estéril em concentração dobrada (1024 µg/mL) em relação à concentração inicial definida e volumes de 100µL diluídos seriadamente 1:1 em caldo BHI 10 %. Em cada cavidade com 100 µL do meio de cultura continha a suspensão bacteriana (multirresistente) diluída (1:10). Os mesmos controles utilizados na avaliação da CIM para os extratos foram utilizados durante a modulação.^11-12As placas preenchidas foram incubadas a 37 ºC por 24 h e após esse período a leitura foi evidenciada pelo uso de resazurina como citado anteriormente no teste de determinação da CIM.

Prospecção Fitoquímica

Os testes fitoquímicos foram utilizados para detectar a presença de metabólitos secundários como: flavonas, flavonóis, xantonas e flavononas foram realizados seguindo o método descrito por Matos.¹³Os testes se baseiam na observação visual da alteração de cor ou formação de precipitado após a adição de reagentes específicos.

Análise estatística dos dados

Os ensaios foram feitos todos em triplicata e expressos como a média geométrica. A análise estatística foi aplicada à análise de variância de duas vias seguido pelo teste de Bonferroni utilizando o software GraphPadPrism 6.0. Foram considerados relevantes valores com o p < 0,05.

RESULTADOS

Após a realização da prospecção fitoquímica foi possível verificar a presença de alguns metabólitos secundários que foram descritos na tabela 2.

Após os testes para determinação da concentração inibitória foi verificado que houve inibição de crescimento das espécies bacterianas testadas. Obtendo-se os seguintes resultados expressos na tabela 3.

Na associação dos extratos com os aminoglicosideos (tabela 3 e figuras 1 e 2) foi possível evidenciar sinergismo dos extratos hexânico e metanólico frente à cepa de S. aureus 358, quando associado com a amicacina, já na associação deste mesmo antibiótico com os extratos contra E. coli 27 houve sinergismo apenas com o extrato metanólico. Efeitos semelhantes foram encontrados na associação dos extratos com a gentamicina exceto contra as cepas de S. aureus 358 onde houve um antagonismo para o extrato hexânico. Através dos resultados dos testes de modulação foi possível verificar que o extrato que teve maior ação sobre as espécies bacterianas testadas foi o metanólico (EMBV).

DISCUSSÃO

Dentre as demais classes de metabólitos secundários destaca-se a forte ação microbiana dos flavonóides. As ações biológicas desses metabólitos secundários vegetais destacam-se também na área da farmacologia devido a seus efeitos biológicos sobre a saúde da espécie humana. Os flavonóides são substâncias aromáticas divididos em diferentes classes, como: flavonas, isoflavonas, antocianinas, que possuem atividades antitumorais, anti-inflamatória e antioxidante, além dos relatos de ações antimicrobianas.^14,15Já os taninos pertencem a um grupo de compostos fenólicos provenientes do metabolismo secundário das plantas e são definidos como polímeros fenólicos solúveis em água que precipitam proteínas. Fatores estes que favorecem e justificam a atividade antimicrobiana de espécies vegetais.

Em relação às demais classes desses metabólitos foram possíveis detectar a presença de catequinas, flavonas e leucoantocianidinas, que possuem funções antioxidante, anti-inflamatória, além de atividade antibacteriana. Segundo Simões ¹⁶ a ausência ou presença de certos constituintes químicos determinados na fitoquímica podem ser explicadas pela época ou horário da colheita, pelo manejo e acondicionamento da planta ou pela degradação dos constituintes por fatores ambientais. Esse fato é importante, pois é nestas condições que revela se a planta está atingindo o seu efeito terapêutico esperado ou não, isso irá depender da presença ou ausência, fator este que pode ter mascarado a presença de alcalóides.

Como a beterraba trata-se de uma planta leguminosa, vale salientar a sua semelhança com o estudo realizado por Guimarães – Beelen¹⁷ onde ele investigou a presença de metabólitos secundários no extrato das folhas de M. tenuiflora, conhecida popularmente como Jurema preta. A presença de taninos condensados aparecem em alta concentração nas leguminosas nativas do semi-árido do Nordeste brasileiro, como é o caso das folhas de jurema preta, por isso é possível verificar a presença desses metabólitos em extratos de diferentes solventes.

A capacidade dos produtos naturais em modificar a ação de antimicrobianos pode ser vista a partir de estudos que demonstram que a associação de drogas sintéticas e extratos de plantas podem atuar revertendo à resistência microbiana eliminando plasmídios ou inibindo a bomba de efluxo. Trabalhos com modulação de produtos derivados de plantas com antibióticos, presentes na literatura, mostram resultados semelhantes aos deste estudo, como foi no caso dos estudos de Turner aulmifolia, Momordica charantia, Mentha arvensis, Sideroxylon obtusifolium, Cordia verbenaceae, Costus aribicus.^18-22

Sinergismo é um termo que se refere neste caso, ao uso de plantas ou drogas em combinação, podendo afetar inúmeros sítios de atuação na bactéria, colaborando com o efeito agonista do produto testado.^23,24

Uma maior atividade antibacteriana e modulatória deste extrato pode está relacionado com a presença de componentes polares, possivelmente pelo fato de o solvente utilizado para a obtenção do extrato é do tipo polar. Silveira²⁵ no seu estudo de frutos de Syagrus oleracea, também verificou que o extrato que teve uma a atividade antimicrobiana foi o metanólico.

Os testes demonstraram um aumento na atividade dos aminoglicosídeos tanto de bactérias gram positivas quanto gram negativas quando associadas aos extratos na maioria dos testes. Sabe-se que os aminoglicosídeos atuam bloqueando a subunidade 30s do ribossomo,²⁶os metabólitos presentes nos extratos podem ter modulado a entrada desse antibiótico na bactéria no mesmo sítio de ligação, ou em alvos diferentes, sendo considerado efetivo o sinergismo da mesma, no entanto esta pesquisa possui limitações para afirmar ao certo, como se deu o sinergismo entre as substâncias.

A possível explicação para o antagonismo apresentado em um dos testes, referese a fatores como a quelação do antibiótico ou de ligação dos compostos a locais específicos dos antibióticos, desse modo reduzindo o espectro de atividade.²³Os mesmos autores afirmam que o antagonismo é devido a um efeito sinérgico multialvo, pois os constituintes de um produto em associação podem afetar a atividade de um ou de outro interferindo com vários alvos.

O estudo demonstrou que os extratos hexânico e metanólico de B. vulgaris reduziram a CIM das bactérias de linhagem padrão e quando associados aos aminoglicosídeos houve potencialização da ação nas espécies bacterianas multirresistentes testadas exceto Staphylococos aureus quando modulado com o antibiótico gentamicina.

Os extratos pesquisados possuem metabólitos secundários que tem uma diversidade de ações, destacando a ação antimicrobiana dos taninos e flavonóides já comprovada em estudos anteriores.

Os resultados obtidos nesta pesquisa são promissores, podendo assim auxiliar em futuros estudos sobre produtos naturais a fim de favorecer a viabilização ao combate à resistência microbiana. No entanto substâncias devem ser isoladas e testadas para possível melhor explicação dos efeitos sinérgicos e antagônico mostrados neste estudo.

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Recibido: 25 de noviembre de 2014.
Aprobado: 20 de septiembre de 2015.

Saulo Relison Tintino. Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular. Departamento de Química Biológica. Universidade Regional do Cariri (URCA). Av. Cel Antonio Luiz, 1161. CEP: 6 3000-000. Crato (CE), Brasil.
Correo electrónico: saulorelison@gmail.com