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ARTÍCULO ORIGINAL
Tamizaje fitoquímico, control de la calidad y actividad antibacteriana del clon UF-650 en extractos de Theobroma cacao L. (cacao)
Phytochemical screening, quality control and antibacterial activity of the UF-650 clone in Theobroma cacao L. (cocoa) extracts
Lillien Fajardo Rosabal,1 Yosvel Viera Tamayo,1 Úrsula M. Rosabal Cordoví,2 Suyén Rodríguez Pérez,3 Yans Guardia Puebla,4 Galina Morales Torres5
1
Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal. Facultad de Ciencias Agrícolas,
Universidad de Granma. Bayamo. Cuba.
2 Laboratorio
Farmacéutico de Líquidos Orales Medilip, Biocubafarma. Bayamo, Granma.
Cuba.
3 LABEX,
Centro de Inmunología Molecular. Santiago de Cuba.
4 Facultad
de Ciencias Técnicas, Universidad de Granma. Bayamo. Cuba.
5 Centro
de Estudios de Química Aplicada, Universidad de Granma. Bayamo. Cuba.
RESUMEN
Introducción:
Theobroma cacao L. presenta gran variedad de metabolitos secundarios
con actividades farmacológicas como antioxidantes, citotóxicos, antitumorales,
analgésicos, antifúngicos, anticoagulantes y antibacterianos. Todavía
son insuficientes las investigaciones en el campo de la fitoquímica y la
evaluación de la actividad biológica de los clones existentes en Cuba.
Objetivo:
Evaluar la composición fitoquímica, los parámetros de calidad
y la actividad antibacteriana del clon UF-650 en los extractos secos y las tinturas
de las hojas y los frutos de T. cacao con el fin de recomendar su uso
para el tratamiento alternativo de las piodermitis.
Métodos:
Se recolectaron muestras de hojas y frutos maduros e inmaduros. El fruto se
separó en semilla y pericarpio y se obtuvieron tinturas al 20 % y extractos
secos. Se realizaron las pruebas correspondientes al control de calidad de las
tinturas según sus especificidades y se evaluó la actividad antibacteriana
frente a bacterias piógenas tanto a las tinturas como a los extractos secos.
Resultados:
El tamizaje fitoquímico de las tinturas al 20 % y de los extractos secos
evidenció gran diversidad de metabolitos bioactivos: quinonas, cumarinas,
flavonoides, fenoles y taninos, taninos pirocatecólicos, carbohidratos
reductores, alcaloides, resinas y aminoácidos libres. Las tinturas al 20
% que se obtuvieron de las hojas, los pericarpios y las semillas se mantuvieron
dentro de los parámetros de calidad transcurridos 6 meses. Se demostró
la actividad antibacteriana de las tinturas al 20 % frente a Staphylococcus
aureus (ATCC 29737). Los extractos secos mostraron aumento de la actividad
frente a S. aureus sp.1, Streptococcus pyogenes sp.1 y S. aureus
(ATCC 29737) cuando aumenta la dosis o la concentración de los extractos.
Conclusiones:
Los resultados del tamizaje fitoquímico, los parámetros de calidad
y la actividad antibacteriana de los extractos secos y las tinturas de las hojas
y los frutos demostraron que los extractos secos del clon UF-650 de T. cacao
pueden utilizarse en el tratamiento alternativo de las piodermitis.
Palabras clave: Theobroma cacao L.; actividad antibacteriana; parámetros de calidad; tamizaje fitoquímico.
ABSTRACT
Introduction:
Theobroma cacao L. contains a large variety of secondary metabolites
with pharmacological activities such as antioxidant, cytotoxic, antitumor, analgesic,
antifungal, anticoagulant and antibacterial. Phytochemical research and evaluation
of the biological activity of the clones existing in Cuba are still insufficient.
Objective:
Evaluate the phytochemical composition, quality parameters and antibacterial
activity of dry extracts and tinctures from leaves and fruits of the UF-650
clone of T. cacao, with the purpose of recommending their use for the
alternative treatment of pyoderma.
Methods:
Samples of mature and immature fruits and leaves were collected. The fruit was
separated into seed and pericarp. 20 % tinctures and dry extracts were obtained
therefrom. Tests were performed to control the quality specifications of the
tinctures. Both the tinctures and the dry extracts underwent evaluation of their
antibacterial activity against pyogenic bacteria.
Results:
Phytochemical screening of the 20 % tinctures and dry extracts revealed a great
diversity of bioactive metabolites quinones, coumarins, flavonoids, phenols
and tannins, pyrocatecholic tannins, reducing carbohydrates, alkaloids, resins
and free amino acids. The 20 % tinctures obtained from leaves, pericarp and
seeds remained within the quality parameters after six months. The 20% tinctures
were found to have antibacterial activity against Staphylococcus aureus
(ATCC 29737). The dry extracts displayed an increase in activity against S.
aureus sp.1, Streptococcus pyogenes sp.1 and S. aureus
(ATCC 29737) as their dosage or concentration increased.
Conclusions:
Results concerning phytochemical screening, quality parameters and antibacterial
activity of dry extracts and tinctures from leaves and fruits showed that dry
extracts from the clone UF-650 of T. cacao may be used for the alternative treatment
of pyoderma.
Key words: Theobroma cacao L., antibacterial activity, quality parameters, phytochemical screening.
INTRODUCCIÓN
Las piodermitis son enfermedades de la piel causadas por bacterias piógenas y en las que se produce pus como resultado del proceso inflamatorio. Su origen está relacionado, por lo general, con la conversión de los gérmenes comensales en gérmenes invasores en determinadas condiciones favorables como heridas, deficiencia del sistema inmunitario, aumento de la virulencia de los microorganismos.1
Las bacterias predominantes en las piodermitis pertenecen al género Staphylococcus y Streptococcus, aunque pueden encontrarse otras, entre las que se destaca Pseudomona aeruginosa.
Las piodermitis constituyen una de las causas más frecuentes de asistencia a la consulta del dermatólogo en las instalaciones médicas. Estas enfermedades ocupan el quinto lugar dentro de las afecciones dermatológicas, representan el 17 % de todas las consultas pediátricas y pueden tener un impacto negativo en el estado nutricional de los niños y en general de los adultos. Son además la causa principal de morbilidad y mortalidad de niños y pacientes inmunodeprimidos en la mayoría de los países de África, Asia y América Latina.1
El tratamiento prescrito en Cuba es el uso de gentamicina en crema o pomada al 0,01 % aplicada en capa fina dos veces al día. Aunque este tratamiento es efectivo, el medicamento es importado, por lo que no se garantiza su existencia en el mercado nacional.
A Theobroma cacao L. (cacao) se le atribuyen diversas actividades farmacológicas como antioxidante, citotóxica, antitumoral, analgésica, antifúngica, anticoagulante, antiinflamatoria, antibacteriana y moduladora de la respuesta inmune.2,3 Pero las investigaciones farmacológicas han estado dirigidas mayormente a su acción antioxidante, y no existen suficientes estudios de la actividad antibacteriana de T. cacao y, específicamente, de los clones existentes en Cuba.
Este trabajo tuvo como objetivo evaluar la composición fitoquímica, los parámetros de calidad y la actividad antibacteriana del clon UF-650 de los extractos secos y las tinturas de hojas y frutos de T. cacao para recomendar su uso en el tratamiento alternativo de las piodermitis.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se seleccionaron hojas y frutos de plantas de Theobroma cacao L. (Sterculiaceae) clon UF-650, colectadas en la Estación Experimental del III Frente Oriental, Santiago de Cuba. La recolección se realizó el 8 de enero de 2015 entre las 9:00 y las 10:00 a.m. con una temperatura entre 25 y 26 °C.
Se identificó la especie en el Departamento de Botánica de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Granma según la Norma Ramal de Salud Pública 311,4 fue confirmada por el especialista de la estación experimental y está depositada con el número 3012 en el herbario del Jardín Botánico Cupaynicú, serie Catasús.
Se tomaron muestras de hojas y frutos maduros e inmaduros. Para su análisis, el fruto se separó previamente en semilla y pericarpio.
El material se secó en una estufa (WSU 400, Alemania) con circulación de aire a 60 ºC durante tres días. Terminado el tiempo de secado se procedió a moler las hojas secas con un molino eléctrico hasta obtener un tamaño de partícula menor a 20 mm de diámetro.
Preparación de las formulaciones farmacéuticas
Tintura al 20
La tintura al 20 % se obtuvo a partir del polvo (tamaño de partícula menor que 2 mm de diámetro) y se utilizó como disolvente una solución etanólica al 70 % (v/v) en agua destilada. Se utilizaron 50 g de la droga cruda para obtener 250 mL de esta tintura. Para obtener la tintura se maceró la droga pulverizada en una zaranda (MLW, Alemania) a 60 rpm durante 15 min a intervalos de 10 h durante siete días según la Norma Ramal de Salud Pública 312,5 la Norma Cubana de Salud Pública 3136 y el Programa de Medicina Tradicional y Natural. 7
Después se filtró la tintura a presión reducida para lograr la homogeneidad y transparencia total del producto. El filtrado (tintura al 20 %) se almacenó en frasco ámbar y reposó durante tres días a temperatura entre 4 y 8 ºC.
Extracto seco
Los extractos secos de las hojas y los frutos se obtuvieron a partir de la tintura al 20 %, se concentraron 200 mL de la muestra a 50 ºC en un rotoevaporador (IKA, RV05 basic, Alemania) y se colocaron en un recirculador de agua para su condensación (MLW, Alemania). Tanto para obtener el extracto seco como para conservarlo se siguió la metodología descrita por Martínez y colaboradores.8
El control de las especificaciones de la calidad de las tinturas al 20 % se realizó según la Norma Ramal de Salud Pública (NRSP) 3125 y la Norma Cubana (NC) 92-02.9
El pH se determinó según se establece en la NC 90-13-1310 con un pehachímetro (Crison, Basic 20, España).
El índice de refracción se determinó con el empleo un refractómetro (Abbe YA-2S, China) según se establece en la NC 90-13-1111 y todas las muestras se trabajaron sin corrección a 25 ºC.
La prueba para determinar los sólidos totales se realizó por duplicado, la cantidad se expresó en g/100 mL y se determinó la densidad relativa a 20 ºC con un densímetro (TG, Spindel III, Alemania).
Tamizaje fitoquímico
Para lograr el mayor agotamiento de la muestra se utilizó el esquema de extracción sucesiva con solventes de polaridad creciente (éter etílico, etanol 82 % y agua). Todos los análisis fitoquímicos se realizaron según el protocolo propuesto por Payo12.
Se le realizó el tamizaje fitoquímico correspondiente al extracto alcohólico tanto al extracto seco como a la tintura.
Evaluación de la actividad antibacteriana de los extractos
Se empleó el método de difusión en agar por diseminación superficial en disco (Bauer-Kirby).13
Las cepas utilizadas en la prueba de la actividad antibacteriana fueron Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC 29737) y Bacillus subtilis (ATCC 6633), esta última no patógena. Se emplearon además una cepa salvaje de S. aureus, denominada S. aureus sp.1, y una de Streptococcus pyogenes, denominada S. pyogeness p.1, aisladas de pacientes con piodermitis en el Centro de Higiene y Epidemiología de Manzanillo, Granma, Cuba.
Se emplearon discos de antibióticos comerciales (Sensi-Disc TM, Francia) de amplio espectro contra cepas bacterianas. Se utilizaron discos de gentamicina (CN) de 30 µg/disco y se escogió este entre otros antibióticos por ser el más usuado en el tratamiento de las piodermitis.
Se prepararon tres soluciones en existencia y se suspendieron nuevamente 0,030; 0,060 y 0,120 g de los extractos secos en 1,0 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para obtener soluciones con una concentración final de 30, 60 y 120 µg/µL, respectivamente. De cada una de estas tres soluciones se aplicaron 6 µL en discos de papel de filtro (pb, sa., Brasil) de 6 mm de diámetro. La concentración final de los extractos en los discos fue de 180, 360 y 720 µg/disco.
Como control negativo se emplearon discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro cargados con 6 µL de DMSO, solvente empleado en la preparación de las soluciones que se evaluaron.
Para preparar los inóculos se tomaron de 3 a 5 colonias semejantes y se trasladaron (asa de inoculación) a 4 y 5 mL de caldo Mueller-Hinton (BioCen, Cuba). Los cultivos en caldo se incubaron en agitación a 100 rpm en una zaranda (MLW, Alemania) a 35 ± 2 ºC por espacio de 2 a 6 h. La turbidez de los mismos correspondió al patrón de turbidez 0,5 de McFarland para una concentración aproximada de 1.5 x 108 UFC/mL.
La prueba se realizó en placas petri (Alumbra, China) de 90 mm de diámetro y de 3-4 mm de espesor que contenían 20 mL/placa de medio agar-sangre (BioCen) (pH 7,3 ± 0,2) para S. pyogenes y agar Mueller-Hinton (Biolife, Italia) (pH 7,3 ± 0,2) para el resto de los microorganismos. Las placas se incubaron a 35 ± 2 ºC por un período de 16 a 18 h en una incubadora Sartorius (China). Los resultados se expresaron como el diámetro (en mm) del halo de inhibición del crecimiento.
Se realizó el análisis estadístico de los datos con el paquete estadístico STATGRAPHICS Plus Versión 5.1 (2002). Se aplicó un ANOVA de clasificación simple en la comparación de varias muestras mediante la prueba de Fisher. En los casos en que hubo diferencias estadísticamente significativas para un valor de p < 0,05 se realizó una prueba de rangos múltiples para determinar las medias que diferían. El método utilizado para distinguir entre las medias fue el procedimiento de las menores diferencias significativas de Fisher (LSD por sus siglas en inglés).
RESULTADOS
Los resultados del tamizaje fitoquímico de las tinturas al 20 % y de los extractos secos de T. cacao (tabla 1) fueron similares y revelaron una amplia diversidad de metabolitos bioactivos; de ellos se encontraron en todas las muestras: quinonas, cumarinas, flavonoides, fenoles y taninos, taninos pirocatecólicos, carbohidratos reductores, alcaloides, resinas y aminoácidos libres.
Se detectaron algunos metabolitos en los extractos secos que no estaban presentes en las tinturas al 20 %, triterpenos en las semillas maduras y saponinas en las semillasmadura e inmaduras.
Los resultados del control de calidad realizado a las tinturas al 20% de las hojas, los pericarpios y las semillas (tabla 2) muestran que las tinturas están dentro de los parámetros de calidad que establecen las normas correspondientes, lo cual garantiza el empleo óptimo de las tinturas al 20 %. El valor de los sólidos totales osciló entre 0,83 y 3,96 g/100 mL, lo que indica que pudieran contener principios activos en concentraciones adecuadas.
El mayor porcentaje de sólidos totales (3,96 %) lo contiene la semilla madura y el valor más bajo (0,83%), las hojas también maduras.
El índice de refracción de todas las tinturas al 20 % estuvo por encima del valor de este parámetro para el agua. Todas las tinturas al 20 % mostraron ser menos densas que el agua, entre 0,883 y 0,907 g/L, esto es lógico por tratarse de soluciones hidroalcohólicas.
El pH entre 5,59 y 7,01 evidencia diferencias en las concentraciones o en los compuestos químicos con propiedades ácidas. Las semillas mostraron los valores de pH más bajos y las hojas inmaduras, los más altos. En general pudo demostrarse que el grado de acidez de las tinturas al 20 % obtenidas de las semillas, maduras e inmaduras, es mayor y en las tinturas obtenidas de los pericarpios y las hojas, en los dos períodos de desarrollo,va disminuyendo hasta el valor de 7,01 (neutro).
Estos resultados se ratificaron con el análisis de calidad de las muestras testigos después de un período de seis meses de reposo sin observarse la formación de sólidos. Se comprobó que los parámetros de calidad mostrados se mantienen bastante constantes.
En la tabla 3 se muestran los resultados de la evaluación de la actividad antibacteriana de las tinturas al 20 % y de los extractos secos correspondientes frente a cuatro cepas bacterianas.
Al analizar los resultados de la actividad antibacteriana de las tinturas al 20 % solo en las semillas se evidencia un resultado promisorio contra S. aureus (ATCC 29737).
En todos los casos, los extractos secos mostraron actividad frente a las cepas S. aureus sp.1, S. pyogenes sp.1 y S. aureus (ATCC 29737) con halos de inhibición entre 7 y 10 mm. Se observó mayor actividad al aumentar la dosis y los mejores resultados (10 mm) correspondieron a los extractos secos de hojas inmaduras. Estos resultados son alentadores porque es posible emplear tanto las hojas como los frutos para el tratamiento de las enfermedades estafilocócicas.
Los extractos crudos obtenidos tienen actividad antibacteriana contra S. aureus (ATCC 29737), S. aureus sp1 y S. pyogenes con tendencia al aumento de la actividad en la medida en que aumenta la dosis sin diferencias estadísticamente significativas entre ellos y los halos de inhibición del crecimiento bacteriano de 7 a 10 mm para la máxima concentración evaluada (720 µg/disco).
Existieron diferencias estadísticamente significativas entre los halos de inhibición de todos los extractos evaluados y la gentamicina.
DISCUSIÓN
Los metabolitos predominantes en hojas, pericarpios y semillas son quinonas, cumarinas, flavonoides, fenoles y taninos, taninos pirocatecólicos, carbohidratos reductores, alcaloides, resinas y aminoácidos libres, y se comportan de manera similar en las tinturas al 20 % y en los extractos secos.
El hecho de que algunos metabolitos se encontraron en los extractos secos y no en la tintura, pudiera explicarse porque la concentración de los metabolitos es mayor en los extractos secos en comparación con las tinturas al 20 %.
Los resultados del tamizaje son muy promisorios y de una gran aplicabilidad debido a la actividad biológica que tienen los extractos. A algunos representantes de las cumarinas también se les atribuyen propiedades antibacterianas.14
Los compuestos flavonoides constituyen uno de los grupos más importantes en cuanto a la actividad farmacológica de T. cacao. A estos metabolitos se les atribuyen propiedades fundamentalmente antioxidante y antibacteriana.15,16
Los representantes de la familia de los alcaloides tienen actividad frente a bacterias gramnegativas17 y se ha comprobado que T. cacao es rico en aminas y alcaloides, incluidas la teobromina (0,5-2,7 %), la cafeína (0,25-1,43 %), la tiramina y la dopamina.14
Por otra parte, las resinas participan en la defensa de la planta frente al ataque de animales herbívoros, insectos y patógenos bacterianos.18
Se ha comprobado el efecto antifúngico de algunos representantes de la familia química de los triterpenos o esteroides19 y a las saponinas se les ha comprobado actividad frente a los estafilococos.17
Existieron variaciones en la composición química y la actividad antibacteriana de las muestras evaluadas en cuanto al desarrollo del tejido vegetal empleado. Este es un resultado esperado, porque se ha documentado que la etapa de desarrollo18 influye en la composición química de los metabolitos secundarios de la planta.
El hecho de que los extractos secos presentaron mejor actividad que las tinturas concuerda con la mayoría de los principios activos que se conocen, para los cuales se cumple que a mayores concentraciones del principio activo mayor actividad biológica.20
Los resultados obtenidos por Ohshima y colaboradores21 demostraron la actividad antibacteriana de T. cacao frente a bacterias patógenas periodontológicas, efecto que se le atribuye a los polifenoles.
Estos resultados son similares a los obtenidos por Perez y Anesini 22 quienes observaron la actividad antibacteriana de los extractos crudos de T. cacao frente a S. aureus.
Según Cuellar y colaboradores,23 la fracción clorofórmica de la cáscara de T. cacao tiene actividad frente a Bacillus cereus así como frente a Streptococcus agalactiae.
El hecho de que no haya actividad de las tinturas al 20 % ni de los extractos secos frente a P. aeruginosa (ATCC 27853) puede deberse a la resistencia de esta bacteria. Henwood y colaboradores24 y Pitt y Sparrow25 observaron este comportamiento en esta especie bacteriana frente a una amplia gama de antibióticos comerciales y demostraron, en todos los casos, que la mayor resistencia de las cepas evaluadas es frente a la gentamicina.
Se han descrito varios mecanismos de resistencia de P. aeruginosa que podrían explicar la falta de actividad de los extractos vegetales. Estos mecanismos son, entre otros, la baja permeabilidad de la pared celular a los agentes antibacterianos, la capacidad genética de expresar una amplia variedad de mecanismos por mutaciones en los genes cromosomales que regulan la expresión genética de resistencia y por la incorporación de genes de resistencia foráneos vía plásmidos, transposones y bacteriófagos.26
Las diferencias estadísticas entre los halos de inhibición de los extractos evaluados y la gentamicina pueden deberse a que los discos comerciales contienen el principio activo de elevada pureza. Por tanto, es probable que si se logra aislar y purificar los principios activos se necesiten concentraciones menores para lograr resultados semejantes a los obtenidos con la gentamicina.
Los resultados del tamizaje fitoquímico, de los parámetros de calidad y de la actividad antibacteriana demostraron que los extractos secos del clon UF-650 de T. cacao pueden utilizarse para el tratamiento alternativo de las piodermitis.
Conflicto de intereses
No existen conflictos de intereses entre los autores ni entre las instituciones que participaron en la investigación.
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Recibido: 4 de
julio de 2016
Aprobado: 11 de abril de 2018
Lillien Fajardo
Rosabal Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal. Facultad de Ciencias
Agrícolas, Universidad de Granma. Bayamo, Granma. Cuba.
Correo electrónico:
email: lfajardor@udg.co.cu
* Autor de correspondencia
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