Estúdio fitoquímico de Euphorbia tirucalli L (avelos), actividad antimicrobiana y ensayos toxicológicos preliminares in vitro

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Estudo fitoquimico de Euphorbia tirucalli L. (avelós), atividade antimicrobiana e ensaios toxicológicos preliminares in vitro

Estudio fitoquímico de Euphorbia tirucalli L. (avelos), actividad antimicrobiana y ensayos toxicológicos preliminares in vitro

 

Phytochemical study of Euphorbia tirucalli L. (aveloz): antimicrobial activity and preliminary in vitro toxicological assays

 

 

Fernando Cesar Martins Betim,I,II Susan Webber De Souza,I,II Roseli Aparecida De Mello Bergamo,I Josiane De Fátima Gaspari DiasII

 I Universidade Tuiuti do Paraná, Curitiba, PR, Brasil.
II Laboratório de Farmacotécnica. Universidade Federal do Paraná Curitiba, PR, Brasil.

 

 

Resumo

Introdução: Euphorbia tirucalli L. é uma planta pertencente à família Euphorbiaceae. Os extratos etanólicos do caule e o látex diluído em água são de uso corrente em Medicina Tradicional. Conhecida popularmente como avelós, vem sendo utilizada devido propriedades medicinais descritas com caráter antiasmático, fungicida, antibacteriano e para o tratamento de picada de escorpiões e de cobras.
Objetivo: Identificar aos grupos de metabólitos presentes na espécie por cromatografia em camada delgada, avaliar a atividade antimicrobiana e a toxicidade aguda do extrato etanólico e frações.
Método: O extrato etanólico foi obtido utilizando os caules frescos da planta em aparelho de Soxhlet e fracionado com os solventes hexano, clorofórmio, acetato de etila e a sobra da extração foi denominada residual. Os extratos etanólico e frações foram padronizados na concentração de 1 g/mL para avaliar o potencial antibacteriano contra Staphylococcus aureus, Shigella flexneri e Enterococcus faecalis. Para avaliação da toxicidade em Artemia salina foram utilizadas as concentrações 1000, 500, 100 e 10 µL/mL dos extratos etanólico e frações. A pesquisa preliminar de metabólitos foi realizada através de cromatografia em camada delgada (CCD).
Resultado: E. tirucalli inibiu o crescimento bacteriano, com inibição para a concentração de 1,0 g/mL dos extratos etanólico e frações. A atividade antibacteriana para o extrato etanólico e as frações, pode ser devida à presença de taninos, saponinas, flavonoides ou terpenos em sua composição química, bioativos evidenciados na pesquisa por CCD. O extrato etanólico e frações apresentaram elevada toxicidade.
Conclusão: O estudo por CCD indicou a presença de alcalóides, terpenos, cumarinas, esteróides, flavonóides e taninos. O ensaio em A. salina demonstrou que a espécie é tóxica. A atividade antimicrobiana foi considerada boa em comparação com os antimicrobianos comerciais.

Palavras chave: Euphorbia tirucalli L.; estudo fitoquímico; potencial antimicrobiano; toxicidade.

RESUMEN

Introducción: Euphorbia tirucalli L. es una planta que pertenece a la família Euphorbiaceae. Los extractos etanólicos de su tallo y el látex diluido en agua son usados comúnmente por la población en la medicina tradicional. Conocida por el nombre popular de avelós, ha sido usada por sus propiedades medicinales como antiasmática, fungicida, antibacteriana y para tratar las picaduras de escorpiones y las mordeduras de serpientes.
Objetivos: Identificar los grupos de metabolitos presentes en esta especie, evaluar la actividad antimicrobiana y la toxicidad aguda del extracto etanólico y sus fraciones.
Métodos: El extracto etanólico se obtuvo mediante el método Soxhlet utilizando el tallo fresco de la planta y se fraccionó con los solventes: hexano, cloroformo, acetato de etilo; lo que sobró de la extracción se denominó residual. Los extractos etanólico y las fracciones se estandarizaron a la concentración de 1 g/mL para evaluar su potencial antibacteriano frente a Staphylococcus aureus, Shigella flexneri, Enterococcus faecalis. Para evaluar la toxicidad frente Artemia salina se utilizaron las concentraciones 1000, 500, 100 e 10 µL/mL de los extractos etanólicos y las fracciones para determinar la CL50. La investigación de los metabolitos se realizó mediante cromografía de capa fina (CCF).
Resultados: E. tirucalli inhibió el crecimiento bacteriano con inhibición para la concentración de 1,0 g/mL de los extractos etanólico y las fracciones. La actividad antibacteriana puede deberse a la presencia de taninos, saponinas, flavonoides o terpenos en su composición química, bioactivos que se observaron en la prueba con CCF. El extracto etanólico y las fraciones presentaron una elevada toxicidad.
Conclusiones: El estudio mediante CCF indicó la presencia de alcaloides, terpenos, cumarinas, esteroides, flavonoides y taninos. El ensayo conn A. salina demostró que la especie es tóxica. La actividad antimicrobiana fue adecuada en comparación con los antimicrobianos comerciales.

Palabras claves: Euphorbia tirucalli L.; estudio fitoquímico; potencial antimicrobiano; toxicidad.

ABSTRACT

Introduction: Euphorbia tirucalli L. is a plant species from the Euphorbiaceae family. Ethanolic extracts from its stem and latex diluted in water are frequently used in folk traditional medicine. Commonly known as aveloz, the species has been used for its medicinal properties as fungicide, antibacterial, to combat asthma and to treat scorpion stings and snakebites.
Objective: Identify the groups of metabolites present in the species and evaluate the antimicrobial activity and acute toxicity of the ethanolic extract and its fractions.
Method: The ethanolic extract was obtained by Soxhlet extraction from the fresh stem of the plant and fractionated with the solvents hexane, chloroform and ethyl acetate. Extraction leftovers were classed as residual. The ethanolic extracts and the fractions were standardized to a concentration of 1 g/ml to evaluate their antibacterial potential against Staphylococcus aureus, Shigella flexneri and Enterococcus faecalis. Toxicity against Artemia salina was evaluated at concentrations of 1000, 500, 100 and 10 µl/ml of the ethanolic extracts and the fractions to determine the CL50. Metabolites were analyzed by thin layer chromatography (TLC).
Results: E. tirucalli inhibited bacterial growth at a concentration of 1.0 g/ml of the ethanolic extracts and the fractions. The antibacterial activity may be due to the presence of tannins, saponins, flavonoids or terpenes in the chemical composition. These bioactive compounds were revealed by the TLC test. Both the ethanolic extract and the fractions displayed high toxicity.
Conclusion: TLC analysis revealed the presence of alkaloids, terpenes, coumarins, steroids, flavonoids and tannins. The assay conducted with A. salina showed that the species is toxic. Antimicrobial activity was found to be adequate when compared with commercial antimicrobials.

Keywords: Euphorbia tirucalli L., phytochemical study, antimicrobial potential, toxicity.

 

 

INTRODUÇÃO

O uso de plantas medicinais no tratamento de doenças é uma estratégia antiga utilizada por praticamente todas as populações do mundo. Registros históricos datados desde 4.000 a.C. comprovam a utilização de plantas na busca pela cura de enfermidades nos povos egípcios e chineses.1

A espécie Euphorbia tirucalli L. é pertencente à família Euphorbiaceae e pode atingir até 9 metros de altura. Morfologicamente, possui troncos verdes cilíndricos extremamente ramificados com folhas pequenas que aparecem apenas no início de seu desenvolvimento. O extrato etanólico total do caule e o látex diluído em água são de uso corrente em Medicina Tradicional.2 Ela é conhecida popularmente como avelós, e é utilizada como planta medicinal para o tratamento antiasmático, fungicida, antibacteriano e para o tratamento de picada de escorpiões e de cobras, entre outros.3,4 O caule da E. tirucalli produz um látex de coloração branca, raramente amarelado e extremamente perigoso. Em contato com a pele é corrosivo podendo provocar lesões, coceira, edema, queimaduras e até necrose dos tecidos. Ao contato com os olhos provoca inchaço, ardência, visão borrada e se a vítima não tiver pronto atendimento médico às lesões podem evoluir até a destruição da córnea provocando cegueira permanente.3,5

Quando ingerido, o látex pode causar vômitos, diarréias e hemorragias por irritação da mucosa gástrica.6 Mesmo com sua alta toxicidade, existem relatos da sua utilização terapêutica datados da idade média em herbários e farmacopeias africanas e de vários países europeus.7

Atualmente, as substâncias de maior interesse farmacológico são os diterpenos do tipo tigliano (ésteres de forbol) para caráter toxicológico, os diterpenos do tipo ingenano (ésteres de ingenol) e o triterpeno eufol com caráter terapêutico.3

Em razão ao aumento da resistência bacteriana às múltiplas drogas antimicrobianas surgem à preocupação e a procura de novas alternativas terapêuticas, com as plantas medicinais representando uma importante fonte para obtenção destes medicamentos. A atividade antimicrobiana de extratos e óleos essenciais de plantas medicinais foi comprovada em vários estudos realizados em países que possuem uma flora diversificada.8-10 Os antibióticos vegetais possuem uma estrutura química que difere daquela dos antibióticos derivados de micro-organismos ou sintéticos, podendo interferir no metabolismo de micro-organismos, ativando ou bloqueando reações e a síntese enzimática, na alteração de estruturas das membranas ou em outras estruturas celulares.11 Porém, desde o advento dos antibióticos, o uso de derivados de plantas como antimicrobianos tem sido incipiente.12 Apesar da grande diversidade de antimicrobianos que agem sobre diversos microrganismos patogênicos, estudos buscam por medicamentos que apresentam maior espectro de ação, baixo custo e menor indício de resistência bacteriana, haja vista que, já existe resistência bacteriana a alguns produtos antimicrobianos.13,14 A resistência a agentes antimicrobianos é preocupante e requer não somente a pesquisa para o desenvolvimento de novas substâncias antimicrobianas, mas também o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento de infecções bacterianas.15 Nessa linha, surge como alternativa o uso de plantas medicinais e as terapias alternativas a partir delas.16

Assim, o presente trabalho teve como objetivo identificar aos grupos de metabólitos presentes na espécie por cromatografia em camada delgada, avaliar a atividade antimicrobiana e a toxicidade aguda do extrato etanólico e frações.

 

MÉTODOS

Coleta e identificação do material botânico

Partes aéreas e caules de Euphorbia tirucalli L. (Euphorbiaceae) foram coletadas no bairro Sítio Cercado, na cidade de Curitiba - PR. O material botânico foi identificado pelo Museu Botânico Municipal (Herbário MBM), do Jardim Botânico de Curitiba. A exsicata está depositada no herbário dessa instituição sob nº de acervo 390003.


Preparo e obtenção do extrato etanólico de E. tirucalli

Depois de colhidas e selecionadas, as partes aéreas (caule) de E. tirucalli foram cortadas e feridas, com auxílio de uma lâmina. Após o corte, realizou a pesagem da planta e esta foi diluída na proporção 1:2 com etanol 70 %. O material foi levado à extração em Soxleht. Após a extração, a planta foi separada do álcool por filtração, concentrando o extrato em rotaevaporador para eliminação do solvente extrator e em seguida congelado e liofilizado. Após a liofilização, foi obtido um látex resinoso com peso de 22 g.


Fracionamento do extrato etanólico

Após reservada a alíquota de extratos etanólico necessária aos procedimentos de bioensaios, o restante do extrato etanólico foi fracionado por extração líquido - liquido, em aparelho de Soxhlet modificado, com os solventes hexano, clorofórmio e acetato de etila (em escala crescente de polaridade). O produto remanescente da última etapa de fracionamento foi denominado como fração residual. Por fim, foram obtidas quatro frações denominadas: hexânica, clorofórmica, acetato de etila e residual correspondendo a quatro polaridades. Estas frações foram avaliadas nos bioensaios e demais testes juntamente com o próprio extrato etanólico, totalizando cinco amostras analisadas.


Estudo fitoquímico por cromatografia em camada delgada (CCD)

Para a realização do ensaio de CCD foram utilizadas cromatoplacas de sílica gel 60 UV254, da marca Whatman®, de dimensões 20 × 20 cm, onde foram aplicados de 5 a 10 µL de cada amostra com microseringas. As análises de CCD foram realizadas conforme a tabela 1.

As placas foram visualizadas sob luz ultravioleta antes e após a revelação com seus respectivos reveladores.



Avaliação da atividade tóxica em Artemia salina

Os ensaios de Artemia salina foram realizados com o extrato etanólico e frações nas concentrações de 1000, 500, 100 e 10 µL/mL, a diluição do extrato foi realizada com 1 % de dimetilsulfóxido (DMSO) e completada com água do mar artificial até a concentração desejada.

Para avaliação do extrato etanólico o e frações E. tirucalli foi utilizado o método que determina a CL50 em µg/mL de compostos ativos e extratos no meios.19 Foi utilizada água do mar artificial, preparada com 30 g de sal marinho e 1.000 mL de água destilada. Os ovos de A. salina (200 mg/400 mL) foram colocados em contato com a água do mar artificial e aerados por uma hora e então incubados em temperatura 27-30 °C por 48 h, com iluminação constante. Para efeitos de controle, os náuplios foram avaliados frente ao solvente utilizado (DMSO 1 % em salina). Como controle negativo (branco) foi utilizado solução salina e como controle positivo Dodecil sulfato de sódio (SDS) nas concentrações de 10, 20, 30, 40 e 50 µg/mL. Foram colocadas em cada tubo contendo a amostra e controles, 10 naúplios de A. salina, os quais foram novamente incubados em temperatura de 27-30 °C por 24 h. Em seguida, foi realizada a contagem de náuplios imóveis. Os dados obtidos foram analisados pelo método estatístico Probitos para a determinação dos valores de CL50 e 95 % de intervalos de confiança. Todos os testes foram realizados em triplicata, sendo consideradas amostras ativas as que CL50 for menor que 1000 ppm (1000 µg/mL).19


Diluição das amostras e atividade antimicrobiana em placas

Para o preparo do extrato diluído em DMSO foram definidas as proporções seriadas a partir de 1 g do extrato etanólico e de suas frações, em 1 mL de DMSO. As soluções obtidas com os extratos foram identificadas em: extrato etanólico (E), extrato hexânico (E1), extrato clorofórmio (E2), extrato acetato de etila (E3), extrato residual (E4). Todos os extratos apresentam concentração de 1 g/mL.

Para a avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos de E. tirucalli, foram utilizadas cepas padrões de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Shigella flexneri (ATCC 12022), Enteroccocus faecalis (ATCC 19433).

Realizou-se então a prova da atividade antibacteriana da espécie E. tirucalli. Em meios de cultura BHI (Brain Heart Infusion) as cepas foram ativadas e levadas ao crescimento em estufa a 36 °C por 48 h. Após o crescimento e turvação do meio, para a confecção da solução inicial a ser inoculada, uma alçada de cada bactéria cultivada em meio BHI, foi suspensa em separado em solução salina estéril e padronizada na escala nefelométrica de Mac Farland, até obter uma turvação compatível com o grau 0,5 da escala. A concentração da solução inicial foi ajustada por diluição de uma suspensão concentrada até o ajuste da turbidez desejada, em absorbância de 600 nm que corresponde a aproximadamente 1,5 × 108 UFC/mL.20 Em meios de cultura Agar Muller Hinton, com auxílio de alça de Drigalsky (500 μL/placa), a suspensão bacteriana foi semeada na superfície do meio. Foram utilizados discos de 6,0 mm de diâmetro, embebidos com 25 μL de cada solução dos extratos em estudo, e as placas foram incubadas a 35 °C durante 48 h. O controle negativo da atividade inibitória dos diluentes, solução salina (bactérias) e DMSO (extratos), foram realizados adicionando 25 μL de diluente em discos e inoculados em placas contendo a solução bacteriana. Como controles positivos foram utilizados discos comerciais de antibióticos referência para as controle das bactérias sendo: amoxicilina paraS. aureus, norfloxacina para S. flexneri e vancomicina para E. faecalis.

Os testes foram realizados em triplicata e os resultados expressos em milímetro (mm) pela média aritmética simples (MD ± desvio padrão) do diâmetro dos halos de inibição formado ao redor dos discos nas três repetições. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p< 0,05, utilizando o modelo ONE-WAY ANOVA e teste de Tukey (significância de 5 %), comparando as medidas dos halos de inibição obtidos pelos diferentes extratos.

 

RESULTADOS

O ensaio fitoquímico em CCD indicou os principais grupos metabólicos que estão presentes nas frações de E. tirucalli, como pode ser observado na tabela 2.



Todos os extratos testados em A. salina apresentarem-se tóxicos, com exceção da fração residual. Os resultados são evidenciados na tabela 3.



No teste de difusão em disco, o extrato etanólico e as frações apresentaram atividade antibacteriana frente às cepas bacterianas ATCC testadas. Os diâmetros dos halos de inibição estão demonstrados na tabela 4.


 

DISCUSSÃO

A análise fitoquímica preliminar é realizada para obter informações qualitativas acerca dos principais grupos de metabólitos presentes na amostra. A cromatografia em camada delgada é um método considerado rápido, eficiente de baixo custo e fácil reprodutibilidade. Esta análise tem como objetivo avaliar as características qualitativas dos principais grupos químicos presentes nos extratos e frações, utilizando reações de coloração e fluorescência. O fracionamento de extratos é importante para separar metabolitos secundários por polaridade crescente. A classe de metabólitos encontrados na triagem por CCD condiz com o esquema de separação proposto por Cequinel-Filho e Yunes.21 Do extrato hexano pode-se obter esteroides e terpenos. Da fração clorofórmio pode-se extrair alcaloides, cumarina e terpenos. Da fração acetato de etila pode-se extrair flavonóide e taninos.

Os testes de toxicidade in vitro são técnicas utilizadas com intuito de diminuir ou substituir métodos que utilizam animais na experimentação, para determinações prévias de toxicidade do material vegetal.

Em geral, os extratos derivados de plantas com alta toxicidade evidenciada em A. salina sugerem alto potencial para atividades biológicas, sendo correlacionado com a atividade contra o Trypanosoma cruzi,22 antimicrobiana e também com a atividade citotóxica em tumores humanos sólidos.23 Pode-se considerar tóxicas amostras que apresentam CL50< 1000 µg/mL,19 ou seja, quase todas as amostras testadas, com exceção da fração residual. Foi descrita uma relação entre o grau de toxicidade em A. salina e a correlação da CL50 mais detalhada:24 a) baixa toxicidade (CL50 > 500 µg/mL); b) moderada toxicidade (100 µg/mL < CL50 < 500 µg/mL); c) alta toxicidade (CL50< 100 µg/mL). A partir da classificação detalhada e da exposição da tabela, observa-se alto potencial tóxico da espécie E. tirucalli. Ensaios em outras espécies do gênero demonstraram toxicidade. Euphorbia kamerunica25 teve alta toxicidade com extrato hexano CL50 0,00 µg/mL e do extrato acetato de etila 1,61 µg/mL Euphorbia conspicua26 apresentou toxicidade de 10 μg/mL do extrato aquoso e Euphorbia hirta27 teve alta toxicidade com CL50 de 0,41 mg/mL do extrato metanólico.

Os micro-organismos testados S. aureus, S. flexneri, E. faecalis, são padrões para testes de suscetibilidade antimicrobiana, responsáveis por infecções em humanos e apresentam elevada resistência aos antimicrobianos comerciais.28

A avaliação da atividade antimicrobiana de E. tirucalli, mostrou que o extrato etanólico e também suas frações apresentaram atividade antimicrobiana frente às cepas de S. aureus, S. flexneri e E. faecalis. Todos os extratos utilizados, exceto o extrato clorofórmio, apresentaram atividade antimicrobiana. O extrato clorofórmio apresentou baixo espectro de ação antimicrobiano frente às outras frações, porém apresentou atividade antimicrobiana, o que já pode ser considerado um resultado positivo. No experimento executado para as bactérias testadas não há descrição na literatura de atividade antimicrobiana de frações orgânicas de E. tirucalli, exceto Sugumar et al.,29 que concluíram o baixo espectro de ação antimicrobiana do extrato clorofórmio de E. tirucalli em Bacillus cereus com halos limitados a 11 mm. Na literatura Simões et al.,30 afirma que o fracionamento do extrato etanólico de plantas com o clorofórmio obtém-se antraquinonas livres, bases livres de alcaloides e glicosídeos cardiotônicos. Cowan31 numa revisão sistemática enumerou os principais elementos antimicrobianos encontrados na natureza e a sua ação contra diferentes micro-organismos. Observou que os fenóis e polifenóis, flavonoides e terpenos são eficazes ativos contra micro-organismos, especialmente bactérias, por sua capacidade de agir na parede celular dos mesmos dissolvendo a parte lipofílica. Nas literaturas não há relatos de atividades antimicrobianas em qualquer componente fitoquímico extraído com clorofórmio para comparação. Para as outras frações há relatos descritos de atividade antimicrobiana nas extrações polares realizadas dos componentes extraídos por cada solvente.

Aljabarin et al.32 descreveu atividades antimicrobianas para o extrato etanólico de E. tirucalli em cepas de S. aureus, S. flexneri e E. faecalis. O extrato etanólico de E. tirucalli apresentou halos de inibição para S. aureus de 12 mm, para S. flexneri de 20 mm e para E. faecalis de 18 mm. Em comparação com os resultados obtidos no experimento, os halos tiveram valores semelhantes aos descritos por Aljabarin et al.,32 onde para S. aureus o halo foi de 18 mm, para S. flexneri o halo foi de 20 mm e para E. faecalis o halo encontrado foi de 18 mm.

Simões et al.30 afirma que o fracionamento com acetato de etila consegue-se extrair flavonoides, cumarinas simples, taninos. Bhuvaneshwar33 considerou os flavonoides como substâncias antimicrobianas eficazes contra uma ampla gama de micro-organismos, provavelmente devido à sua capacidade de formar um complexo extracelular com proteínas solúveis e com parede celular bacteriana. Atividade antimicrobiana de taninos pode estar relacionada com a sua capacidade de inativar aderências microbianas, enzimas e proteínas de transporte do envelope celular, eles também formam complexos com polissacarídeos.34 O látex da E. tirucalli é rico em terpenos, como os ésteres de forbol, eufol, ingenóis, e flavonoides.2

A fração residual apresentou atividade antimicrobiana, possivelmente pela presença de terpenos ou outros componentes que podem ter atividade antimicrobiana. Teplitski et al.35 afirma que terpenos são importantes alternativas para o controle de patógenos, já que seus efeitos, ainda não totalmente descritos, podem ativar ou inativar compostos, rompendo ou até desestruturando as membranas agindo sobre compostos lipofílicos causando a perda de enzimas e nutrientes da membrana celular bacteriana. Também não houve relatos na literatura que comprovassem a atividade antimicrobiana do extrato residual de E tirucalli.

A investigação fitoquímica dos extratos etanólicos das partes aéreas e caule de E. tirucalli frescas resultaram na verificação da presença de alcaloides, flavonoides, saponinas, esteroides, terpenoides, cumarinas e resina.36

A atividade antibacteriana, detectada para o extrato e frações, podem ser devida à presença de taninos,34 saponinas e flavonoides,37 ou terpenos em sua composição química, pois há relatos na literatura que descrevem atividades antimicrobianas dessas classes de compostos.38,39

Os resultados do presente estudo sugerem que compostos presentes em E. tirucalli, podem ser promissores na obtenção de novas drogas com potencial antimicrobiano, porém mais estudos devem ser realizados para esclarecer o mecanismo de ação das substâncias biológicas. É importante avaliar o efeito tóxico dos compostos em longo prazo, visto que a planta é considerada tóxica, já que há interesse em descobrir novas drogas com espectros terapêuticos bons e com baixa ocorrência de efeitos colaterais.

Os resultados permitem concluir que o estudo fitoquimico por CCD indicou a presença de metabolitos como alcalóides, terpenos, cumarinas, esteróides, flavonóides e taninos. O ensaio em A. salina demonstrou que a espécie é altamente tóxica, indo com relatos pertinentes a família Euphorbiaceae. A atividade antimicrobiana foi considerada boa em comparação com antibióticos comerciais.

 

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Recibido: 28 de octubre de 2016.
Aprobado: 28 de febrero de 2017.

 

 

Fernando Cesar Martins Betim. Laboratório de Farmacotécnica -Universidade Federal do Paraná Curitiba, PR, Brasil.
Correo electrónico: fernandobetim@hotmail.com



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