Inducción de reticulocitos micronucleados en la sangre periférica de ratones con formulado de Chuquiraga jussieui J.F. Gmel

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Inducción de reticulocitos micronucleados en la sangre periférica de ratones con una suspensión de Chuquiraga jussieui J.F. Gmel

 

Induction of micronucleated reticulocytes in peripheral blood of mice receiving a suspension of Chuquiraga jussieui J.F. Gmel

 

 

Alex Alberto Dueñas Rivadeneira,1 Ulbio Eduardo Alcívar Cedeño,2 Carlos Cedeño Palacios,2 Hipatia Delgado Demera,3 Norma Batista Hernández,4 Osmany Marrero Chang5

1 Departamento de Procesos Agroindustriales. Facultad de Ciencias Zootécnicas. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador.
2 Departamento de Procesos Químicos. Facultad de Ciencias Matemáticas, Físicas y Químicas. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador.
3 Departamento de Ciencias Veterinarias. Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Técnica de Manabí. Ecuador.
4 Unidad de Investigaciones biomédicas. Universidad Médica Serafín Ruíz de Zárate Ruíz.
5 Grupo de Toxicología Experimental, Departamento Biológico, Centro de Bioactivos Químicos. Universidad Central de Las Villas. Santa Clara. Cuba.

 

 

RESUMEN

Introducción: Las especies vegetales que crecen en la cordillera de los Andes han desarrollado características únicas que solo se hallan en estos ecosistemas del continente americano con abundante y variada flora. Particularmente en Ecuador se conoce el uso tradicional de diferentes especies, entre ellas Chuquiraga jussieui J.F. Gmel para el tratamiento de diferentes enfermedades, aunque no se cuenta con estudios completos sobre la seguridad de los extractos obtenidos de dichas especies.
Objetivo: Determinar si una suspensión de C. jussieui provoca la formación de reticulocitos micronucleados en la sangre periférica de ratones como indicador de clastogenicidad y aneugenicidad.
Métodos: Se utilizó la técnica de tinción ultravital con naranja de acridina para evaluar la posibilidad que tiene la suspensión de C. jussieui de producir reticulocitos micronucleados en la sangre periférica de ratones de la línea NMRI. La suspensión de C. jussieui se administró por vía oral en 3 dosis a razón de 10 mL/kg de peso corporal. La frecuencia de reticulocitos micronucleados se evaluó a las 48 y 72 h después de la administración y se observó la frecuencia de dichas alteraciones en 2000 células por animal en cada tiempo de evaluación.
Resultados: No se encontraron diferencias estadísticas significativas para p< 0,05 en el número de reticulocitos micronucleados en los grupos de tratamiento en relación con el grupo de control con vehículo; sin embargo, se evidenciaron diferencias significativas respecto al control patrón de genotoxicidad.
Conclusiones: La sustancia de ensayo no mostró clastogenicidad ni aneugenicidad en las condiciones de este experimento.

Palabras clave: Chuquiraga jussieui; genotoxicidad; micronúcleos.

ABSTRACT

Introduction: The plant species that grow in the Andes mountains range have developed unique characteristics only found in these ecosystems of the American continent, characterized by their abundant and variegated flora. Particularly in Ecuador a number of different species, among them, Chuquiraga jussieui JF Gmel, are known to have been traditionally used to treat various conditions, though thorough studies are not available about the safety of the extracts obtained from them.
Objective: Determinate whether a C. jussieui suspension induces the formation of micronucleated reticulocytes in the peripheral blood of mice as an indicator of clastogenicity and aneugenicity.
Methods: Ultravital staining with acridine orange was used to evaluate the potential of a C. jussieui suspension to produce micronucleated reticulocytes in the peripheral blood of mice of the NMRI line. The suspension was administered orally in 3 dose at a rate of 10 mL/kg body weight. The frequency of micronucleated reticulocytes was evaluated at 48 and 72 h after administration, and the frequency of such alterations was observed in 2 000 cells per animal at each evaluation time.
Results: Significant statistical differences were not found for p< 0,05 in the number of micronucleated reticulocytes between the treatment groups with respect to the vehicle control. However, significant differences were found with respect to the genotoxicity pattern control.
Conclusions: The study substance did not show any clastogenicity or aneugenicity in these experimental conditions.

Key words: Chuquiraga jussieui, genotoxicity, micronuclei.

 

 

INTRODUCCIÓN

Las especies vegetales que habitan en la cordillera de los Andes han desarrollado características únicas que sólo se hallan en estos ecosistemas del continente americano debido a las condiciones agrestes que soportan y a la temperatura y altura de esta región. En particular en Ecuador, con una abundante y muy variada flora, se conoce el uso tradicional de diferentes especies por parte de la población nativa de la región desde tiempos ancestrales, entre ellas Chuquiraga jussieui J.F. Gmel, la cual se conoce como flor del caminante, flor de los Andes, chuquiraga y chuquiraguac. Esta es una especie botánica de la familia Asteraceae y su flor es reconocida como la flor nacional de Ecuador1.

Según la tradición popular, de la planta se usan las hojas y los tallos conservados en etanol para tratar el reuma, la fiebre y la inflamación; la resina es utilizada como cataplasma en cardenales, heridas y para aliviar los dolores producidos por luxaciones y fracturas. La infusión o decocción de las partes aéreas se utiliza para el tratamiento de enfermedades de la próstata y del estómago, quemaduras, heridas superficiales, úlceras y como antipirético 1. Sin embargo, no existen estudios científicos sobre su seguridad.

En la actualidad se aconseja la utilización de una batería de ensayos de corta duración3 para detectar el potencial genotóxico de las sustancias químicas. Las agencias reguladoras internacionales recomiendan una serie de ensayos in vitro e in vivo diseñados para determinar cuáles compuestos provocan daños genéticos directa o indirectamente a través diferentes mecanismos.4

Entre los sistemas claves con mamíferos in vivo está la prueba de micronúcleos (MN), la cual mide la capacidad de una sustancia para causar roturas cromosómicas o retrasos en la migración de los cromosomas por alteraciones del huso mitótico. 5-8 Este ensayo se ha usado en una amplia variedad de organismos y células, entre los que se incluyen plantas, células de animales y cultivos de células en humanos, y desde entonces ha sido ampliamente utilizado como marcador del daño genotóxico.9,10 Hayashi reporta una técnica donde se detectan los micronúcleos en los reticulocitos en la sangre periférica de ratones utilizando una tinción ultravital con naranja de acridina.11,12

Hasta el presente se ha evaluado escasamente la efectividad y seguridad de los extractos C. jussieui, planta de interés para desarrollar bebidas biofuncionales. Por todo lo anterior, fue necesario evaluar si la suspensión de C. jussieui en agua destilada y metilcelulosa al 2 % provoca la formación de reticulocitos micronucleados en la sangre periférica de ratones como indicador de clastogenicidad y aneugenicidad.

 

MÉTODOS

El estudio analítico experimental fue realizado en el Centro de Toxicología (CENTOX) de la Universidad de Ciencias Médicas de Villa Clara "Serafín Ruíz de Zárate Ruiz".

Material vegetal

Las plantas de C. jussieui se colectaron en la cordillera de los Andes, en la reserva faunística del volcán Chimborazo, en Ecuador, en las coordenadas de latitud 1º30´32.66´´ S y longitud 78º51´52.91´´ O. Dicha planta está registrada y caracterizada desde el punto de vista botánico, fitosanitario y taxonómico con el número de voucher Ad 001 del Herbario de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador.

Las partes aéreas de la planta (follaje y tallos) se lavaron con abundante agua potable, el material se colocó en bandejas esmaltadas y las muestras se mantuvieron a la sombra. Se removió frecuentemente el material. Se pesó cada 24 h hasta que en tres determinaciones se observó una pérdida de peso constante.

Preparación del polvo

El material seco se pasó por un molino de cuchillas y un tamiz de 1,5 mm de abertura de la malla. El equipo operó a una velocidad aproximada de 1400 rpm. Luego se pasó el sólido por un tamiz de acero inoxidable de 0,315 mm para convertirlo en un polvo con un tamaño de partícula uniforme, que se almacenó en una bolsa de plástico sellada herméticamente para su uso posterior.

Animales

Se utilizaron 30 ratones machos adultos jóvenes de la línea NMRI, procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), por la baja incidencia espontánea de MN y alta sensibilidad a diferentes mutágenos.

Los animales, en edades comprendidas entre 8 y 12 semanas y con un peso de 20 a 25 g, fueron alojados en el Centro de Toxicología (CENTOX) de la Universidad Médica de Villa Clara, Cuba y se mantuvieron durante todo el estudio a temperatura de 21 ± 2 0C, humedad relativa entre un 40 y 70 %, intensidad luminosa entre 200 y 250 Lux y en ciclos de luz y oscuridad de 12 por 12 h.13 Los ratones se alojaron en cajas de policarbonato, con cama de bagazo de caña procesado y esterilizado; recibieron dieta comercial para roedores, suministrada por el CENPALAB, y agua apta para el consumo humano. Tanto la comida como el agua se esterilizaron, y comieron y bebieron a voluntad.

Sustancia de ensayo

Las sustancias se prepararon justo antes del momento de administrarlas. Tanto el control como la sustancia de ensayo (C. jussieui) se prepararon en una suspensión con agua destilada y metilcelulosa al 2 %, SIGMA, EE.UU.

Se tomó en consideración que el extracto acuoso de C. jussieui no mostró efectos tóxicos en los estudios previos sobre toxicidad aguda por vía oral (dosis límite) realizados en ratones14. Siguiendo los criterios establecidos para las sustancias sólidas no tóxicas, seleccionamos para nuestro estudio tres dosis, una dosis máxima de 2000 mg/kg de peso corporal y dos dosis inferiores que corresponden a la mitad y a la cuarta parte de la dosis máxima (1000 mg/kg y 500 mg/kg), respectivamente.15

Como medida de sensibilidad del biomodelo empleado se utilizó el patrón de genotoxicidad de la ciclofosfamida, SIGMA, en una dosis de 40 mg/kg.

La sustancia de ensayo en 3 dosis (alta 2000 mg/kg, media1000 mg/kg y baja 500 mg/kg), el control positivo y el vehículo en dosis única y en un volumen de 10 mL/kg, como se observa en la tabla 1, se administraron por vía oral mediante una cánula sólida esofágica, además se compararon con un grupo control sin tratamiento. Todos los grupos estuvieron formados por 5 animales.

Métodos y técnicas

Se procedió según la técnica descrita por Hayashi 11 para preparar la lámina cubierta con naranja de acridina. Se tomó la muestra de sangre periférica mediante tijereteado apical de la cola a las 48 y 72 h después de los tratamientos, se hizo el montaje y la tinción de la lámina con naranja de acridina (SIGMA Aldrich) para observar y contar los reticulocitos (RETs).

Análisis estadístico

Se compararon los valores medios de RETsMN para cada grupo tratado con respecto al control con vehículo, control positivo y control sin tratamiento, mediante el análisis estadístico de Kruskal Wallis con el paquete estadístico IBM SPSS versión 20. No se realizaron pruebas paramétricas por no cumplirse las condiciones necesarias. Se trabajó con una confiabilidad del 95 %.

El potencial de inducción de RETsMN se determinó mediante la comparación estadística de la frecuencia de RETsMN por cada 2000 reticulocitos en los grupos de tratamiento respecto al grupo control con vehículo.

 

RESULTADOS

Se muestran en las tablas 2 y 3 los resultados de la evaluación de la capacidad que tiene la suspensión de C. jussieui para producir reticulocitos micronucleados observables en las células sanguíneas periféricas a las 48 y 72 h después de la administración.

 

 

DISCUSIÓN

Tal como puede observarse, la suspensión de C. jussieui no produce efecto mutagénico en el sistema de ensayo. No se observaron frecuencias de aparición de reticulocitos micronucleados estadísticamente significativas en los grupos a los cuales se les administró la suspensión de C. jussieui en tres concentraciones diferentes, ni entre estos y los respectivos controles de vehículo y los no tratados.

Asimismo, se encontraron diferencias estadísticamente significativas al comparar los grupos tratados y los de controles respecto al grupo que recibió la dosis de toxicidad para este tipo de ensayo, la ciclofosfamida; lo cual evidencia que el sistema de ensayo funcionó y fue sensible.

La toxicidad celular que da lugar a la rotura del ADN y a la consiguiente aparición de aberraciones cromosómicas, medidas como aparición de reticulocitos micronucleados, no pudo observarse en nuestro estudio, ya que los índices de genotoxicidad en los grupos tratados con 500, 1000 y 2000 mg/kg de peso corporal de la suspensión de C. jussieui no indican un incremento significativo de este índice respecto al grupo de control negativo.

Estos resultados negativos muestran que, en las condiciones probadas, la suspensión preparada de C. jussieui no es genotóxica en ratones NMRI, ya que no produjo un aumento significativo de la frecuencia de micronúcleos en los eritrocitos policromáticos de la sangre periférica en las dosis evaluadas.

En la búsqueda bibliográfica de evaluaciones de la planta en estudio no se encontró que se le hayan realizado ensayos de seguridad genotóxicológica a dicha planta.

Varias especies pertenecientes a la familia Asteraceae, a la cual pertenece la planta en estudio, han sido investigadas por poseer metabolitos con acciones biológicas beneficiosas y otras capaces de producir efectos tóxicos. Este último es el caso de las plantas que contienen alcaloides de pirrolizidina, toxinas naturales, probablemente las de mayor distribución, que afectan tanto a especies de la fauna silvestre como al ganado y al ser humano.16 -18 La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO por sus siglas en inglés)19 estableció cuáles son las familias de plantas más distintivas en estos aspectos, las Asteraceae (Compositae), las Boraginaceae y Fabaceae (Leguminosae).

Con respecto a las propiedades genotoxicológicas de las plantas pertenecientes a la familia de las Asteraceae, se han evaluado varias especies usadas popularmente como medicamento sin resultados positivos en uno o más ensayos. Entre las plantas estudiadas se encuentran Artemisia abrotamum L., Artemisia absinthium L.,Bidensalba L., Matricaria recutita L. y Xanthium strumarium L.20

La suspensión de C. jussieui no causa la formación de reticulocitos micronucleados en la sangre periférica de los ratones. Asimismo, la sustancia de ensayo no mostró clastogenicidad ni aneugenicidad en las condiciones de este experimento.

Declaración de conflictos

Los autores manifiestan que no existe ningún conflicto de intereses y que el artículo no contiene ningún material que vulnere los derechos de autor o de propiedad de terceras personas, y asumimos toda la responsabilidad sobre los datos, los hechos y las opiniones que en el artículo se encuentran.

 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Villagrán C, Romo M, Castro V. Etnobotánica del sur de los Andes de la primera región de Chile:Rev Chun (Chi) 2003;35(1):73-124.

2. Choy WN. Genetic toxicology and cancer risk assessment. New York: Marcel Dekker Inc; 2001.

3. Aaron CS. Evaluation of drug candidate in a battery of short term genetic toxicology assays. Overview. Mutat Res. 1989; [citado 2015 nov 2]; 223 (2): 105-109. Disponible en: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0165121889900384

4. ICH. International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Genotoxicity: A Standard Battery for Genotoxicity testing of Pharmaceuticals. USA: ICH; 2013.

5. Kirsch-Volders M, Plas G, Elhajouji A, Lukamowicz M, González L, Van de Loock K, et al. The in vitro MN assay in 2011: origin and fate, biological significance, protocols, high throughput methodologies and toxicological relevance. Arch Toxicol. 2011; 85(8):873-899.

6. Arencibia D, Vidal A, Rosario L, Suárez Y, Delgado L. Biomodelos para la inducción de micronúcleos en células de la médula ósea por ciclofosfamida y bleomicina. RevVacci. 2011 abr [citado 2015; nov 26]; 20(1): 28-33. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025-028X2011000100005&lng=e

7. Fenech M, Kirsch-Volders M, Natarajan AT, Surrales J, Croft J, Parry J, et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in human cells. Mutagenesis. 2011; 26 (1):125-132.

8. Samanta S, Dey P. Micronucleus and its applications. DiagCyto. 2012; 40(1): 84-90.

9. Palacio Betancur I, Palacio Baena J, Camargo Guerero M. Micronuclei test application to wild tropical ichthyic species common in two lentic environments of the low zones in Colombia. Rev Actu Biol. ¡2009; 31 (90).

10. Fortin F, Anghel T, Brochu P, Lemieux N. Optimizing urothelial cell preparation for the human urinary micronucleus assay. Toxicol In Vitro. 2010; 24(6):1821-7.

11. Hayashi M, Morita T, Kodama Y, Sofuni T, Ishidate M. The micronucleus assay with peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides. Mutat Res 1990; 278: 209-213.

12. Cedano Díaz A, Martínez González S, Escalera Valente F, Salgado Moreno S, Carrillo Díaz F, Macías Coronel H, et al . La prueba de micronúcleos en sangre como bioindicador de genotóxicos. RevAb Vet. 2012; 2 (2):10-14.

13. Guide for the care and use of laboratory animals. National Academic Press. Washington. DC. USA. 1996; p 21-59.

14. Dueñas Rivadeneira A, Cortés Rodríguez R, Marrero Chang O, Pérez Donato J, Olazabal Manso E. Toxicidad aguda del extracto hidroalcohólico de la planta Chuquiraga jussieui administrado vía oral en ratas. Rev La Técnica. 2013; 10: 12-17.

15. Phillips MD, Nascimbeni B, Tice R, Shelby M. Induction of micronuclei in mouse bone marrow cells: an evaluation of nucleoside analogues used in the treatment of AIDS. Environ Mol Mutagen. 1991;18(3):168-83.

16. Langel D, Ober D, Pelser P. The evolution of pyrrolizidine alkaloid biosynthesis and diversity in the Senecioneae. Phytochem Rev.2011;10 (1):3-74.

17. Kempf M, Heil S, Hasslauer I, Schmidt L, von der Ohe K, Theuring C, et al. Pyrrolizidine alkaloids in pollen and pollen products. Mol. Nutr Food Res. 2010;54(2):292-300.

18. Kempf M, Reinhard A, Beuerle T. Pyrrolizidine alkaloids (PAs) in honey and pollen-legal regulation of PA levels in food and animal feed required. Mol. Nutr. Food Res. 2010;54(1):158-168.

19. FAO/OMS. Comisión del CODEX alimentarius. Documento de debate sobre los alcaloides de pirrolizidina. Programa conjunto FAO/OMS sobre normas alimentarias. Comité del CODEX sobre contaminantes alimentariosCX/CF 11/5/14. Italia: FAO; 2011. Sánchez Lamar A, Fonseca López G, Capiro Trujillo N, Fernández Fuentes D. Propuesta de ruta crítica para la evaluación genotóxica de plantas medicinales en Cuba. Rev Cubana Farm 2000;34(1):34-43.

 

 

Recibido: 19 de diciembre de 2016
Aprobado: 25-de marzo de 2018

 

 

Alex Alberto Dueñas Rivadeneira , Departamento de Procesos Agroindustriales. Universidad Técnica de Manabí. Ecuador.
Correo electrónico: alduri81@hotmail.com

 

 

Auspician: Universidad Técnica de Manabí y Universidad Central de Las Villas.

 

 



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