Caracterización física, análisis fitoquímico, huella digital cromatográfica, capacidad antioxidante y actividad antimicrobiana de los frutos de Vitex megapotamica

Boris Javier Michajluk Barboza; Diana Bazán; Laura Mereles; Rosa Degen; Nelson Alvarenga

Caracterización física, análisis fitoquímico, huella digital cromatográfica, capacidad antioxidante y actividad antimicrobiana de los frutos de Vitex megapotamica

Artículo original

Caracterización física, análisis fitoquímico, huella digital cromatográfica, capacidad antioxidante y actividad antimicrobiana de los frutos de Vitex megapotamica

Physical characterization, phytochemical analysis, cromatographic fingerprinting, antioxidant capacity and antimicrobial activity of Vitex megapotamica fruits

Javier Michajluk^1* ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7167-7009
Diana Bazán² ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3945-9196
Laura Mereles¹ ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4195-8958
Rosa Degen³ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7376-7761
Nelson Alvarenga² ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7949-7341

¹Departamento de Bioquímica de Alimentos. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Nacional de Asunción. Paraguay.
²Departamento de Fitoquímica. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Nacional de Asunción. Paraguay.
³Departamento de Botánica. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Nacional de Asunción. Paraguay.

*Autor para correspondencia. Correo electrónico: jmichajluk@yahoo.es

RESUMEN

Introducción: En Paraguay las plantas se utilizan desde hace mucho tiempo en la medicina popular, entre ellas la especie Vitex megapotámica (Spreng) Moldenke.
Objetivo: Caracterizar los frutos de V. megapotámica según sus particularidades físicas, su perfil fitoquímico, sus componentes volátiles, su capacidad antioxidante total y su actividad antimicrobiana.
Métodos: Los especímenes se cosecharon en el barrio Madame Lynch de Asunción para obtener el extracto metanólico de los frutos. Se secaron la cáscara y la pulpa, se homogeneizaron a polvo fino y se sometieron a extracción con metanol. Para analizar el perfil fitoquímico se emplearon reacciones de precipitación, coloración y cromatografía en capa fina. Se empleó un cromatógrafo gaseoso acoplado a espectrómetro de masas para determinar el perfil cromatográfico de los componentes volátiles. Se determinó la capacidad antioxidante total (CAT) mediante la prueba de decaimiento del radical DPPH^• y decoloración del catión radical ABTS^•+. Los fenoles totales se determinaron según el método de Folin-Ciocalteu y se evaluó la actividad antimicrobiana mediante el método de microtitulación en placa.
Resultados: Los resultados del perfil fitoquímico indicaron la presencia de esteroides o triterpenos, flavonoides, naftoquinonas, antraquinonas, leucoantocianidinas y lactonas terpénicas. En la fracción volátil, el 1,2,3,-propanotriol-1-monoacetato fue el compuesto más abundante. La CAT observada en el extracto fue 0,393 µM equivalentes de ácido ascórbico (EAA) por cada gramo en el ensayo DPPH^• y de 9,67 µM equivalentes de Trolox (TEAC)/g en el ensayo ABTS^•+. El contenido de fenoles totales observados fue 80,2 mg GAE/100g. El extracto mostró ligera actividad antibacteriana contra B. subtillis.
Conclusiones: Los resultados mostraron la presencia de diferentes compuestos químicos que pueden estar asociados a las actividades biológicas de V. megapotamica, especialmente las relacionadas con los radicales libres, lo cual puede ser de interés fundamentalmente para prevenir determinadas enfermedades.

Palabras clave: Vitex megapotamica, frutos, perfil fitoquímico, huella digital cromatográfica, actividad antimicrobiana, capacidad antioxidante.

ABSTRACT

Introduction: In Paraguay plants have been used in folk medicine for a very long time. One example is the species Vitex megapotamica (Spreng) Moldenke.
Objective: Characterize the fruits of V. megapotamica based on their physical features, phytochemical profile, volatile components, total antioxidant capacity and antimicrobial activity.
Methods: Specimens were collected from Madame Lynch neighborhood in Asunción to obtain a methanolic extract from the fruits. The peel and pulp were dried, homogenized to fine powder and subjected to methanol extraction. Phytochemical profiling was based on color and precipitation tests and thin-layer chromatography. Gas chromatography - mass spectrometry was used to determine the chromatographic profile of volatile components. Total antioxidant capacity (TAC) was determined by DPPH^• radical scavenging and ABTS^•+ radical cation decolorization assays. Total phenols were determined by the Folin-Ciocalteu method, while antimicrobial activity was assessed by the microtiter-plate method.
Results: Phytochemical profiling revealed the presence of steroids or triterpenes, flavonoids, naphthoquinones, anthraquinones, leucoanthocyanidins, and terpene lactones. The most abundant compound in the volatile fraction was 1,2,3,-propanetriol-1-monoacetate. The TAC observed in the extract was 0.393 µM ascorbic acid equivalents (AAE) per gram in the DPPH ^• assay and 9.67 µM Trolox equivalents (TEAC)/g in the ABTS^•+ assay. Total phenolic content was 80.2 mg GAE/100g. The extract displayed slight antibacterial activity against B. subtilis.
Conclusions: Results revealed the presence of a number of chemical compounds which may be associated to the biological activities of V. megapotamica, particularly those related to free radicals. This may be of interest mainly to prevent certain diseases.

Key words: Vitex megapotamica, fruits, phytochemical profile, chromatographic fingerprint, antimicrobial activity, antioxidant capacity.

Recibido: 23/02/2018
Aprobado: 11/04/2019

INTRODUCCIÓN

Vitex megapotamica (Spreng.) Moldenke pertenece a la familia Lamiaceae (ex Verbenaceae ). Es un árbol que se conoce con el nombre común de "tarumá", se localiza en las regiones tropicales del mundo y constituye una especie de interés por sus propiedades medicinales.⁽¹⁾ Puede alcanzar hasta 20 m de altura, su tronco tiene un diámetro de hasta 60 cm, florece de septiembre a noviembre y es fácil de identificar por el color violeta de su copa. En el Paraguay se halla en zonas bajas de la región oriental y en el Chaco húmedo. En el Brasil es conocido como "tarumá-aceituna" y está distribuido desde los estados de Minas Gerais hasta Rio Grande do Sul.⁽²⁾ Sus frutos son drupas de superficie lisa y brillante, de color rojo oscuro, comestibles y de sabor dulce.⁽³⁾

La composición de los frutos de V. megapotamica han sido poco estudiados. En Paraguay, en un estudio preliminar del fruto realizado por Michajluk y otros,⁽²⁾ se analizaron, los componentes mayoritarios: el agua, los carbohidratos totales (15,4 g/100 g), la fibra alimenticia (5,33 g/100 g), así como bajos niveles de proteínas y grasas. En cuanto a su aporte mineral, Los frutos de V. megapotamica pueden aportar minerales de importancia nutricional como potasio (196 mg/100 g), fósforo (23,8 mg/100 g), calcio (12,2 mg/100 g) y en menor concentración hierro y zinc. Por otro lado, en el Brasil, Caldeira y otros⁽⁴⁾realizaron estudios acerca de los macronutrientes contenidos en los frutos de Vitex cymosa Bert. y reportaron 9 g/100 g de carbohidratos totales (no amiláceos), 4,66 g/100 g de fibra alimenticia y un bajo contenido de grasa.

En el Paraguay, las plantas son utilizadas desde hace mucho tiempo en la medicina popular en zonas rurales y urbanas⁽⁵⁾ En la última década, los países vecinos han tenido grandes avances en los estudios químicos y farmacológicos de las plantas medicinales con el objetivo de obtener y producir nuevos compuestos con propiedades terapéuticas, por eso es válido aproximarse también a estos resultados en el país.⁽¹⁾

Uno de los objetivos de la investigación de plantas (medicinales o no) es la búsqueda de nuevos antimicrobianos. Se estima que cada año, solo en los Estados Unidos de América, las bacterias resistentes a los antibióticos causan más de 2 millones de enfermedades y alrededor de 23 000 muertes. La resistencia a los antibióticos es una amenaza para los seres humanos y también para otras áreas como la veterinaria, la agricultura y la industria. Por este motivo parece apropiado estudiar también a esta especie en búsqueda de dicha actividad.⁽⁶⁾

Si bien la composición y la actividad de los extractos de las hojas de V. megapotamica y sus efectos beneficiosos están descritos en la literatura, la información sobre la composición química, los componentes volátiles, el potencial antioxidante y la actividad antimicrobiana del fruto es limitada.

Por todo lo antes mencionado, el objetivo de este trabajo fue caracterizar los frutos de V. megapotámica según sus particularidades físicas, su perfil fitoquímico, sus componentes volátiles, su capacidad antioxidante total y su actividad antimicrobiana.

MÉTODOS

Los frutos maduros de Vitex megapotámica se recolectaron en el mes de enero de 2016 mediante un muestreo por conveniencia en el barrio Madame Lynch de Asunción, Paraguay (25°16´00.1" latitud sur y 57°33´07.1" longitud oeste).

Posteriormente las muestras se identificaron en el Departamento de Botánica de la Facultad de Ciencias Químicas como V. megapotámica. Se elaboró el ejemplar de herbario (Y. González 112) y se depositó en el Herbario de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Nacional de Asunción (Herbario FCQ) para su indexación.

Se cosecharon manualmente 2,5 kg de frutos maduros que cayeron al sacudir las ramas del árbol, y se descartaron aquellos frutos que presentaban daños visibles causados por las aves o los insectos.

Caracterización física de los frutos

Para la caracterización física del fruto se tomaron 40 unidades de manera aleatoria para observar el color, el peso, el diámetro y la longitud del fruto fresco. Se separó la semilla de la cáscara y la pulpa y se secó sobre papel en un lugar aireado y sombreado para luego pesarse y medirse.

Obtención del extracto metanólico de los frutos

Se extrajeron y se desecharon las semillas de los frutos. La cáscara y la pulpa se secaron en una estufa de aire circulante a 40 °C durante 8 días y se homogenizaron hasta polvo fino en un equipo procesador de alimentos (Bella, Montreal, Canadá). El polvo seco obtenido se sometió a extracción con metanol p.a. en una proporción de 200 g de muestra seca/L de solvente a temperatura ambiente por espacio de 5 días. Posteriormente, se filtró la muestra y se eliminó el solvente mediante evaporación a presión reducida en un evaporador rotatorio (Gerhardt, Sao Paulo, Brasil) a una temperatura de 40 °C. El extracto seco obtenido se conservó en un recipiente hermético a una temperatura de 4 °C hasta el momento de realizar el análisis fitoquímico.

Análisis fitoquímico de los extractos metanólicos

Para determinar el perfil fitoquímico del extracto metanólico, se realizaron pruebas cualitativas empleando reacciones de precipitación, coloración y cromatografía de capa fina (TLC) según la metodología descrita por Sanabria-Galindo⁽⁷⁾ con el fin de determinar la presencia de metabolitos secundarios tales como alcaloides, esteroides y triterpenos, flavonoides, taninos, naftoquinonas y antraquinonas, saponinas, leucoantocianidinas, lactonas terpénicas, cumarinas, cardenólidos y lactonas α - β insaturadas.

Determinación de los componentes volátiles por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (huella digital)

Se empleó un cromatógrafo gaseoso acoplado a espectrómetro de masas marca Shimadzu, modelo 2010 plus (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón). Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes: columna Rtx-5MS de 30 m de longitud, 0,25 mm de diámetro y 0,25 µ de espesor de fase estacionaria, temperatura del inyector 250 ^°C, temperatura del detector 220 ^°C, elución con rampa de temperatura que se inició a 40 °C durante 5 min y luego se incrementó hasta 220 ^°C a 7 ^°C/min y se mantuvo esa temperatura durante 10 min. La velocidad lineal del gas portador fue de 35 cm/seg, la inyección se realizó en modo Split (radio 1:20) y el volumen de inyección fue de 1 µL. En relación con el espectrómetro de masas, se utilizó el modo Scan con un voltaje de 1,4 kV y un rango de masas de 35 a 400 m/z.

Fenoles totales y capacidad antioxidante total

Los reactivos utilizados para determinar los antioxidantes fueron el reactivo de fenol de Folin-Ciocalteu (FCPR), ácido gálico, carbonato de sodio, 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS), persulfato de potasio, metanol, etanol y 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), todos de calidad analítica de la marca Sigma-Aldrich. Los estándares ácido ascórbico y TROLOX (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-cromano-2-carboxílico), se adquirieron en Sigma-Aldrich y Merck, respectivamente.

Determinación de fenoles totales

El análisis de los fenoles totales se realizó según Singleton y otros⁽⁸⁾mediante el método de Folin-Ciocalteu con algunas modificaciones experimentales. Se midió el contenido de fenoles totales mediante espectrofotometría, se realizó una dilución 5:50 con agua destilada debido a la coloración muy intensa de los extractos originales. A 250 μL de cada extracto se le adicionaron 1,25 mL del reactivo (previamente diluido con agua destilada 1:10 v/v) y se dejó reposar durante diez minutos a temperatura ambiente.

Posteriormente se añadió 1 mL de solución de Na₂ CO₃ 7,5 % p/v a la mezcla, se incubó a 40 °C en baño de agua por 30 minutos en la oscuridad, se enfrió a temperatura ambiente y la absorbancia resultante se midió en un espectrofotómetro a 650 nm. El blanco de muestra se preparó siguiendo los mismos pasos, pero la muestra de prueba se reemplazó con la misma cantidad de agua destilada.

Para cuantificar los fenoles totales se utilizó un estándar de ácido gálico en concentraciones de 20 a 200 μg/mL. Los resultados se corrigieron para las diluciones de los extractos elaborados y se expresaron como mg equivalentes de ácido gálico (GAE) por cada 100 g de extracto. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

Determinación de la capacidad antioxidante total (CAT) mediante la prueba de decoloración del radical ABTS^•+

La CAT se determinó según Re y otros⁽⁹⁾ mediante la prueba de decoloración del catión radical 2,2'-azino- bis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico-ABTS^•+) con algunas modificaciones experimentales.

Para la prueba ABTS se diluyeron los extractos en una proporción 1:50. El radical catiónico ABTS^•+se generó mediante la reacción de 7 mL de una solución de ABTS (7 mM) con 7 mL de K ₂S₂O₈ 2,45 mM (1:1) y se mantuvo en la oscuridad a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 horas antes de su uso. El radical es estable en esta forma durante más de dos días si se almacena en la oscuridad a temperatura ambiente.

La mezcla que contenía la solución ABTS^•+ se diluyó 5:200 con etanol hasta una absorbancia de 0,700 (± 0,02) a 720 nm. Posteriormente se realizaron cuatro diluciones distintas de cada triplicado, se adicionó 2 000 μL del reactivo ABTS diluido, se incubó por 30 minutos a 35 °C en baño de agua. Se empleó como blanco de reactivo 200 μL de agua + 2 000 μL del reactivo de trabajo. Se midieron las absorbancias a 730 nm en el espectrofotómetro.

Para la cuantificación de la capacidad antioxidante total se realizó una curva de calibración con diluciones del estándar TROLOX (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-cromano-2-carboxílico) 0,05 g/ 5mL metanol + 5 mL agua destilada y se completó con etanol un volumen de 100 mL con concentraciones de 40 a 600 μg/mL.

Los resultados se corrigieron para las diluciones obtenidas de los extractos y se expresaron como la concentración inhibitoria 50 (IC ₅₀) en μg/mL, además como μM TROLOX equivalente por cada gramo de extracto.

Determinación de la capacidad antioxidante total (CAT) mediante la prueba de decaimiento del radical DPPH ^•

Siguiendo el método publicado por Kanta Sahu y otros,⁽¹⁰⁾ el protocolo para la prueba DPPH se modificó ligeramente para el experimento. En cubetas de plástico para espectrofotometría se mezcló 1 mL de solución metanólica de DPPH (60 μM) con 1 mL de extracto de diferentes concentraciones (50-750 μg/mL en metanol). La mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y la disminución de la absorbancia se midió espectrofotométricamente a 514 nm. Se prepararon blancos de extractos correspondientes (300 μL extracto + 1700 μL metanol), una mezcla de 1 ml de metanol y 1 ml de solución de DPPH se empleó como blanco de reactivo. El ácido L-ascórbico se usó como referencia y con él se realizó una curva de calibración en concentraciones de 0,70-14,08 μg/mL. Se corrigieron los resultados para las diluciones de los extractos y se expresaron como la concentración inhibitoria 50 (IC₅₀) en μg/mL y como μM equivalente del ácido ascórbico por cada gramo de extracto.

Análisis estadístico

Los resultados de CAT y de fenoles totales presentados corresponden al promedio de tres repeticiones (n= 3) ± desviación estándar de la media. Para registrar y procesar los datos obtenidos se utilizó una planilla del software Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., CA, EE.UU.). Se utilizó la prueba Q de Dixon para identificar y rechazar los valores atípicos en cada serie de repeticiones de los diferentes análisis con un nivel de significancia del 95 %.

Evaluación de la actividad antimicrobiana

La prueba se realizó mediante el método de microtitulación en placa, descrito por Saker y otros⁽¹¹⁾ ligeramente modificado. Se utilizaron placas de plástico estériles de 96 pocillos. La concentración inicial de los extractos fue de 10 mg/mL. A la solución se le añadió además DMSO (dimetilsulfóxido) de tal manera que la concentración de este último en la solución final fuera de 10 %. Esta solución fue depositada en los primeros dos pocillos de la primera columna de la placa y se realizaron diluciones seriadas con una pipeta multicanal, de forma que cada pocillo contuviera 50 µL de la muestra en concentraciones descendentes.

Los inóculos bacterianos se ajustaron al valor 0,5 de la escala de Mc Farland (10⁸ UFC/mL) empleando un turbidímetro y se diluyeron en relación 1:20 con medio de cultivo. A continuación, se añadieron a los pocillos 50 µL de la suspensión y se obtuvo volumen final en cada pocillo de 100 µL.

Se destinaron dos columnas de cada placa para el control positivo y el control negativo. Las placas se incubaron a 36 ± 1 °C durante 24 horas. Transcurrido ese tiempo, a cada pocillo se le agregó 10 µL de solución de resazurina a una concentración de 6,75 mg/mL, y se volvió a incubar durante 4 horas. Posteriormente se procedió a leer la placa.

El cambio de color del indicador de azul a rosado se interpretó como crecimiento microbiano positivo. La concentración más baja que no evidencio crecimiento microbiano se tomó como la concentración mínima inhibitoria (CMI). La sustancia de referencia utilizada fue el antibiótico Ciproflaxina en una concentración inicial de 32 µg/mL.

Microorganismos analizados

Se utilizaron cepas de Staphylococcus aureus (American Type Culture Collection, ATCC 25923), Bacillus subtillis. (ATCC 6633), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC 35218) y Klebsiella pneumoniae (Colección Española de Cultivos Tipo, CECT 367).

RESULTADOS

Caracterización física

Los frutos de V. megapotamica son esféricos y de superficie lisa, de color verde cuando no están maduros y entre rojo oscuro y negro cuando maduraron y de consistencia carnosa.

Los valores referentes a las características físicas de los frutos se presentan en la tabla 1.

Estudio fitoquímico

De la extracción con metanol se obtuvieron 104 g de extracto seco a partir de 1 080 g de la pulpa y la cáscara de los frutos. El rendimiento fue de 9,62 %. Los resultados del análisis fitoquímico preliminar de los extractos metanólicos se resumen en la tabla 2.

Análisis cromatográfico de los componentes volátiles

Respecto a los componentes volátiles del extracto metanólico de los frutos de V. megapotamica, el 1,2,3,-propanotriol-1-monoacetato fue el compuesto más abundante. El cromatograma se muestra en la figura y los resultados se recogen en la tabla 3.

Fenoles totales y capacidad antioxidante total (CAT)

La tabla 4 muestra el contenido de fenoles totales y los resultados de la capacidad antioxidante total (CAT).

Actividad antimicrobiana

Los resultados de la actividad antimicrobiana del extracto de los frutos de V. megapotamica se resumen en la tabla 5.

DISCUSIÓN

Los pesos del fruto (4,57 g) y de la semilla (0,445 g) determinados en este estudio son superiores a los mencionados por Cosmo y otros⁽³⁾ quienes reportan para el fruto de V. megapotamica un peso promedio de 3,17g y para la semilla 0,35g.

Por sus características, los frutos del V. megapotamica no son completamente aprovechables debido a que para su consumo deben ser separadas la cáscara y la pulpa comestibles de la semilla la cual representa aproximadamente el 10 % del peso del fruto entero; Cosmo y otros⁽³⁾ refieren 11 % para la misma especie. Un estudio comparativo realizado por Caldeira y otros⁽⁴⁾ con los frutos de tarumá (Vitex cymosa Bert) y la guayaba (Psidium guineense SW) reportaron que los frutos de guayaba son totalmente aprovechables pues para su consumo no es necesario separar las semillas del fruto; sin embargo, los frutos de tarumá se consumen previa separación de la semilla lo que puede llegar a representar hasta el 22 % del fruto.

Por otro lado, el análisis fitoquímico reveló resultados positivos para esteroides y triterpenos, flavonoides, naftoquinonas y antraquinonas; además de leucoantocianidinas y lactonas terpénicas. Se observaron resultados negativos para alcaloides, taninos, saponinas, cumarinas y cardenólidos.

El perfil fitoquímico preliminar realizado en los frutos permitió conocer los diferentes metabolitos secundarios presentes. Algunos de estos componentes han demostrado poseer acciones terapéuticas beneficiosas como los flavonoides, esteroides y triterpenos, las naftoquinonas y lactonas terpénicas.⁽¹²⁾

Los componentes volátiles más abundantes son ésteres, alcoholes y ácidos, lo cual es común en los frutos. Según Thewes y otros,⁽¹³⁾ por lo general, los ésteres son las sustancias responsables del aroma característico que poseen.

Algunos de los metabolitos secundarios encontrados en el extracto metanólico de los frutos han demostrado tener acción terapéutica en el tratamiento de ciertas enfermedades que afectan a la salud humana, pues según Faccim y otros⁽¹⁾ los compuestos fenólicos inhiben la peroxidación lipídica y la lipoxigenasa, y la presencia de estos compuestos en los frutos podría concederles cierta actividad antiinflamatoria e hipolipidémica.

Un estudio sobre los diferentes extractos de las hojas de V. megapotamica demostró que el potencial antioxidante de estos extractos implicaba mecanismos de secuestro de radicales libres, particularmente en los extractos más polares, que extraían mayores cantidades de constituyentes fenólicos. Sin embargo, a pesar de que existen evidencias que apuntan a los compuestos fenólicos como responsables de estos efectos, no deberían excluirse otros metabolitos que pudieran colaborar de manera integrada a los efectos antioxidantes de esta especie.⁽¹⁴⁾

Los triterpenos y los esteroides observados en esta investigación también poseen actividad antiinflamatoria y hormonal. Las leucoantocianidinas y los flavonoides, además de tener acción antinflamatoria, también actúan como antivirales, antimicrobianos y antioxidantes.⁽¹⁵⁾ Por otro lado, las naftoquinonas y antraquinonas destacan por su actividad antiparasitaria, antifúngica, antibacteriana y anticancerígena, además de poseer acción antitrombótica y antiinflamatoria.⁽¹⁶⁾

La evaluación de la actividad antioxidante mostro capacidad captadora frente a los radicales ABTS^•+y DPPH^•; sin embargo, el contenido de fenoles totales (FT) observado fue menor (Tabla 4) a lo reportado en los extractos etanólicos de las hojas de la misma planta, donde los valores varían de 310 a 1 840 mg GAE/100g.^(14,15)

El extracto analizado mostró menor actividad antioxidante que los estándares de referencia de ácido ascórbico y TROLOX en los ensayos de DPPH^• y ABTS^•+, respectivamente, ya que se necesita mayor concentración de extracto para obtener la inhibición del 50 % de los radicales.

Becker y otros⁽¹⁴⁾ indicaron que el uso de solventes de diferentes polaridades en el proceso de extracción es una estrategia importante para detectar variaciones en los niveles de fenoles totales y flavonoides, así como la actividad antioxidante en muestras de hojas de V. megapotamica, esto sugiere que extractos diferentes en los frutos con diferente polaridad, podrían mejorar la CAT observada, lo que permite anticipar estudios futuros en este campo, en función del perfil fitoquímico observado.

Por otro lado, la evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto metanólico de los frutos de V. megapótamica ha mostrado una leve actividad contra Bacillus subtillis donde la concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto metanólico fue de 10 mg/mL.

El extracto fue inactivo contra Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae.

Comparando nuestro resultado con otras especies de Vitex, advertimos que Nagarsenker y otros¹⁷ reportaron que los extractos de las hojas de Vitex negundo mostraron actividad antibacteriana sobresaliente contra B. subtillis y S. aureus, y que, de los cinco microorganismos evaluados, B. subtillis fue el organismo más sensible a todos los extractos.

Por otro lado, en un estudio realizado por Abiodun y otros⁽¹⁸⁾ se evidenció la actividad antimicrobiana del extracto crudo de las hojas de Vitex doniana con CMI de 93,75 μg/mL contra B. subtillis. Otros resultados del mismo estudio indicaron que más fraccionamiento del extracto crudo de las hojas dio como resultado fracciones con menor actividad antibacteriana. Por otro lado, el extracto de la corteza de V. doniana en solventes de diferente polaridad dio como resultado una actividad antibacteriana mejorada contra S. aureus y M. luteus. También otra especie de Vitex como V. trifolia mostró actividad antimicrobiana contra bacterias grampositivas y gramnegativas.

Sobre la base de los resultados obtenidos, el extracto metanólico de los frutos de V. megapótamica se mostró inactivo frente a los microorganismos ensayados excepto contra B. subtillis. Aunque la CMI es elevada, se procederá al fraccionamiento del extracto y al ensayo de las fracciones frente a este microrganismo, teniendo en cuenta que la concentración de los componentes activos en ciertas fracciones podría disminuir el valor de la CMI, lo cual se ha observado con anterioridad en varios estudios.^(17,18) Por otro lado, a partir de los resultados de este estudio y de otros mencionados con anterioridad, se pone de manifiesto que los compuestos con actividad antimicrobiana se concentran principalmente en las hojas y casi nada en los frutos de la planta.

Como conclusión, se puede decir que la información adquirida es de suma importancia debido a que en el país no existen datos acerca de investigaciones realizadas sobre los frutos de V. megapotamica y este es, de acuerdo con nuestro conocimiento, el primer trabajo sobre el perfil fitoquímico, la huella dactilar, la capacidad antioxidante y la actividad antimicrobiana de esta especie.

La valorización de estos frutos poco consumidos en nuestro país, permitirá incursionar en campos más amplios de investigación y de esta manera contribuir a la industria farmacéutica y alimentaria con nuevos conocimientos, además de potenciar su uso en el ámbito de la recuperación de los frutos autóctonos.

REFERENCIAS

1. Faccim T, Zadra M, Forbrig A, Boligon A, Frohlich J, Athayde M. Análise fitoquímica preliminar das folhas de Vitex Megapotamica (Sprengel) Moldenke. Saúde (2011);2:57-42.

2. Michajluk J, Wiszovaty L, Piris P, Mereles L, Caballero S. Estudio del valor nutricional de frutos de Vitex megapotamica, Tarumá. Revista Rojasiana (2014);13(2):45-51.

3. Cosmo N, Gogosz A, Nogueira A, Bona C, Kuniyoshi Y. Morfologia do fruto, da semente e morfo-anatomía da plántula de Vitex megapotámica (Spreng.) Moldenke. Rev. Acta Bot. Bras. (2009);23:389-97. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1590/SO102-33062009000200010

4. Caldeira S, Aiko P, Lima M, Ramos M. Caracterizaçao físico-química do araçá (Psidium guineense SW.) e do tarumá (Vitex cymosa Bert) do estado de Mato Grosso do Sul. Digital Library of Journals (2004);22:145-154. Disponible en: http://dx.doi.org/10.5380/cep.v22i1.1186

5. Alvarenga N, Hiebert M, Bazán D. Composición química y actividad antimicrobiana del extracto etanólico de Begonia cucullata Willd. var. cucullata (Agrial). Revista Investigaciones y estudios de la UNA (2012);8:21-31.

6. Centro de Control y Prevención de Enfermedades, CDC. Antibiotic Use in the United States, 2017: Progress and Opportunities. US Department of Health and Human Services. Atlanta; 2017.

7. Sanabria Galindo A. Análisis fitoquímico preliminar. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias. Departamento de Farmacia. Bogotá; 1983.

8. Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventos R. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Methods enzymol. (1999);299:152-78.

9. Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yangg M, Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology & Medicine (1999);26:1231-37.

10. Kanta Sahu R, Routray R. DPPH Free Radical Scavenging Activity of Some Leafy Vegetables used by Tribals of Odisha, India. Journal of Medicinal Plants Studies (2013);1(4):21-27.

11. Sarker S, Nahar L, Kumarasamy Y. Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals [Methods]. Pub Med Central (2007);42(4):321-24.

12. Dewick PM. Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach, 3rd Edition. John Wiley & Sons, Ltd. 2009.

13. Thewes F, Both V, Brackmann A, Ferreira D, Wagner R. 1-methylcyclopropene effects on volatile profile and quality of 'Royal Gala' apples produced in Southern Brazil and stored in controlled atmosphere. Ciência Rural (2015);45(12):2259-66. Disponible en: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-478 205001202259&lng=n&tlng=en

14. Becker S, Abatti D, Tessaro A, Buss A. Total Phenolic, Flavonoid Content and Antioxidant Activity of Vitex megapotamica (Spreng.) Moldenke. Revista Ciencia e Natura (2016);38:1197-1204. Disponible en: http//:www. redalcyc.org/articulo.oa?id=467547716006

15. Faccim T, Zadra M, Piana M, Boligon A, Frohlich J, Freitas R, et al. HPLC Analysis of Phenolics Compounds and Antioxidant Capacity of Leaves of Vitex megapotamica (Sprengel) Moldenke. Molecules (2013);18:8342-57.

16. López L, Lluvia I, Leyva E, García R. Las naftoquinonas: más que pigmentos naturales. Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas (2011);42:6-17. Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=57918590002

17. Nagarsekar K, Nagarsekar M, Kulkarni S. Evaluation of composition and antimicrobial activity of supercritical fluid extract of leaves of Vitex negundo. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences (2010);72(5):641. Disponible en: www.ijpsonline.com/articles/evaluation-of-composition-and-antimicrobial-activity-of-supercritical-fluid-extract-of-leaves-of-vitex-negundo.html

18. Abiodun O, Sood S, Osiyemi O, Agnihotri V, Gulatti A, Ajaiyeoba E, Singh B. In vitro antimicrobial activity of crude ethanol extracts and fractions of Terminalia catappa and Vitex doniana. African Journal of Medicine and Medical Sciences (2015);44(1),21-26.

Contribución de los autores

Javier Michajluk: Responsable principal de la elaboración y redacción del artículo. Toma de muestra. Caracterización física de los frutos. Obtención del extracto metanólico. Ensayos fitoquímicos y preparación de reactivos. Participación de reactivos y participación en la determinación de fenoles totales y capacidad antioxidante total.

Diana Bazán: Determinación de metabolitos secundarios a través de ensayo fitoquímico. Evaluación de la actividad antimicrobiana.

Laura Mereles: Determinación de fenoles totales y capacidad antioxidante total. Preparación de reactivos y ensayos generales.

Rosa Degen: Muestreo. Identificación botánica. Elaboración del herbario. Correcciones finales del artículo.

Nelson Alvarenga: Determinación de componentes volátiles por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas. Análisis de resultados obtenidos. Correcciones finales del artículo.

Conflicto de intereses

Los autores expresan que no tienen conflicto de intereses.