Avaliação do potencial citogenotóxico de Zingiber officinale Roscoe (gengibre), Zingiberaceae

Elisa dos Santos Cardoso; Ana Aparecida Bandini Rossi; Eliane Cristina Moreno de Pedri; Vinícius Vinícius Delgado da Rocha; Alex Souza Rodrigues; Patrícia Ana de Souza Fagundes

Avaliação do potencial citogenotóxico de Zingiber officinale Roscoe (gengibre), Zingiberaceae

Artículo original

Avaliação do potencial citogenotóxico de Zingiber officinale Roscoe (gengibre), Zingiberaceae

Evaluación del potencial citogenotóxico de Zingiber officinale Roscoe Zingiberaceae (jengibre)

Evaluation of the cytogenotoxic potential of Zingiber officinale Roscoe, Zingiberaceae (ginger)

Elisa dos Santos Cardoso^1* ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9477-1743
Ana Aparecida Bandini Rossi¹ ORCID: https://orcid.org/0000-0002-8318-5375
Eliane Cristina Moreno de Pedri¹ ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7044-581X
Vinícius Delgado da Rocha² ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7336-7223
Alex Souza Rodrigues¹ ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4040-5654
Patrícia Ana de Souza Fagundes¹ ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6790-5635

¹Laboratório de Genética Vegetal e Biologia Molecular. Universidade do Estado de Mato, Alta Floresta. MT, Brasil.
²Laboratório de Biologia Molecular e Filogeografia - BIOAGRO. Universidade Federal de Viçosa. Viçosa, MG, Brasil.

^*Autor correspondente: elisabyo@gmail.com

RESUMO

Introdução: A história da civilização humana está intimamente relacionada à utilização de plantas para prevenção e tratamento de doenças. Dentre as plantas utilizadas pela medicinal tradicional está o Zingiber officinale Roscoe (Zingiberaceae), que apresenta-se também como uma espécie promissora no combate ao câncer.
Objetivo: Avaliar o potencial citotóxico e genotóxico de extratos aquosos e hidroalcoólico de Z. officinale.
Métodos: Bulbos de Allium cepa L. (Amaryllidaceae) foram submetidos ao tratamento descontínuo e, após o enraizamento, transferidos para cinco concentrações dos extratos de Z. officinale , para o controle negativo (água destilada) e para o controle positivo (glifosato 1 %). O experimento foi mantido em câmara de germinação, com temperatura controlada (± 25 °C) e ausência de luz, por um período de 48 horas após exposição aos extratos.
Resultados: O índice mitótico foi afetado por todas as concentrações e extratos testados, diferindo significativamente do controle negativo. O extrato hidroalcoólico promoveu maior redução no índice mitótico, não diferindo estatisticamente do controle positivo. A quantidade de células com anormalidades e aberrações cromossômicas foi pequena e não significativa.
Conclusão: A espécie apresenta potencial para pesquisas relacionadas à prevenção e ao tratamento de tumores e os resultados obtidos reiteram a importância de estudos sobre a toxicidade de plantas medicinais e a orientação para utilização adequada pela medicina tradicional.

Palavras chave: antiproliferativo; fitoterápico; índice mitótico.

RESUMEN

Introducción: La historia de la civilización humana está estrechamente relacionada con el uso de las plantas para la prevención y el tratamiento de las enfermedades. Una de las plantas utilizadas en la medicina tradicional es Zingiber officinale Roscoe (Zingiberaceae), la cual es también una especie prometedora contra el cáncer.
Objetivo: Evaluar el potencial citotóxico y genotóxico de los extractos acuosos e hidroalcohólicos de Z. officinale.
Métodos: Los bulbos de Allium cepa L. (Amaryllidaceae) se sometieron a tratamiento discontinuo y, después del enraizamiento, se transfirieron a cinco concentraciones diferentes de los extractos de Z. officinale . Se utilizó como control negativo agua destilada y como control positivo glifosato al 1 %. El experimento se mantuvo en la cámara de germinación con temperatura controlada (± 25 °C) y ausencia de luz durante 48 horas después de exponerlos a los extractos.
Resultados: El índice mitótico fue afectado por todas las concentraciones y los extractos probados, y se diferenciaron significativamente del control negativo. El extracto hidroalcohólico causó una mayor reducción del índice mitótico, pero no sediferenicó estadísticamente del control positivo. La cantidad de células con anormalidades y aberraciones cromosómicas fue pequeña y no significativa.
Conclusiones: La especie presenta potencial para realizar investigaciones relacionadas con la prevención y el tratamiento de tumores. Los resultados de esta investigación reiteran la importancia de continuar estudiando la toxicidad de las plantas medicinales y las indicaciones para usarlas adecuadamente en la medicina tradicional.

Palabras clave: antiproliferativo; fitoterapia; índice mitótico.

ABSTRACT

Introduction: The history of human civilization is closely linked to the use of plants for disease prevention and treatment. One of the plants used in traditional medicine is Zingiber officinale Roscoe (Zingiberaceae), which is also a promising species against cancer.
Objective: Evaluate the cytotoxic and genotoxic potential of Z. officinale aqueous and hydroalcoholic extracts.
Methods: Allium cepa L. (Amaryllidaceae) bulbs were subjected to discontinuous treatment and after rooting they were transferred to five different concentrations of Z. officinale extracts. Distilled water was used as negative control and 1 % glyphosate as positive control. The experiment was kept in a germination chamber at controlled temperature (± 25 °C) and absence of light for a period of 48 hours after exposure to the extracts.
Results: The mitotic index was affected by all the concentrations and extracts tested, and it was significantly different from the negative control. The hydroalcoholic extract caused a greater reduction in the mitotic index, but it was not statistically different from the positive control. The number of cells with chromosomal abnormalities and aberrations was small and non-significant.
Conclusions: The study species is a potential topic for future research about tumor prevention and treatment. The results obtained confirm the importance of further studies on the toxicity of medicinal plants and the indications for their appropriate use in traditional medicine.

Key words: antiproliferative, phytotherapy, mitotic index.

Recibido: 03/05/2018
Aprobado: 09/11/2018

INTRODUÇÃO

A capacidade de promover alterações metabólicas celulares bem como de induzir alterações no material genético representam, respectivamente, o potencial citotóxico e genotóxico de determinadas substâncias, sendo que estas podem ser de origem natural ou antropogênica.⁽¹⁾

Substâncias potencialmente tóxicas podem estar presentes tanto em alimentos quanto em fitoterápicos tradicionais e seus efeitos estão relacionados a fatores como exposição (frequência, quantidade e tempo) e características específicas da substância. A utilização de plantas para prevenção e tratamento de doenças está intimamente relacionada à história da civilização humana, sendo aplicada também ao controle de pragas.^(2,3)

Dentre as diversas plantas utilizadas na fitoterapia tradicional, o Zingiber officinale Roscoe (Zingiberaceae), conhecido popularmente como "gengibre", está entre as mais estudadas, com algumas propriedades já testadas cientificamente.⁽⁴⁾ A parte mais utilizada do Z. officinale é o rizoma, especialmente para tratamento de problemas gastrointestinais, embora também apresente características terapêuticas como ação antiemética, antimicrobiana, anti-inflamatória, antipirética, diurética, antioxidante, hepatoprotetora, expectorante, antiespasmódica e radioprotetora, além de contribuir para diminuição e controle de glicemia e colesterol.^(5,6)

Estudos sugerem que o Z. officinale possa agir por desmutagênese e bioantimutagênese, possuindo uma boa capacidade de prevenção de danos no DNA, de modo que pode ser utilizado como um alimento funcional capaz de prevenir lesões potencialmente relacionadas ao aparecimento do câncer.^(7,8)

As principais formas de utilização do Z. officinale, assim como das demais plantas medicinais, seguem as orientações da sabedoria popular, sendo que o crescente uso de fitoterápicos tradicionais para tratamento e prevenção de doenças implica na necessidade de pesquisas sobre o potencial citotóxico e genotóxico dos mesmos, uma vez que estes podem ser influenciados pela metodologia de preparo e pela concentração utilizada.⁽⁹⁾

A avaliação do potencial citotóxico e genotóxico de plantas medicinais pode ser realizada por meio do teste com Allium cepa L. (Amaryllidaceae), validado pelo Programa Internacional de Segurança Química (IPCS, OMS) e pelo Programa Internacional das Nações Unidas (UNEP) e que atua como uma primeira avaliação em estudos relacionados à saúde humana, sendo que os resultados obtidos são indicativos de respostas semelhantes em mamíferos ou outros organismos.^(1,10,11)

A eficiência do teste A. cepa está relacionada ao fato da espécie possuir cromossomos grandes, o que facilita a avaliação microscópica, e em número reduzido (2n = 2x = 16).⁽¹¹⁾ Outros fatores importantes são a disponibilidade de bulbos a preços acessíveis durante todo o ano, o crescimento rápido de suas raízes, apresentando grande número de células em divisão, e a não exigência de conhecimento específico para o manuseio.

Diante da ampla utilização do Z. officinale como fitoterápico tradicional, este estudo avaliou o potencial citotóxico e genotóxico do extrato aquoso e hidroalcoólico da espécie por meio do teste A. cepa.

MÉTODOS

O estudo foi realizado no Laboratório de Genética Vegetal e Biologia Molecular do CETAM (Centro de Tecnologia da Amazônia Meridional), na Universidade do Estado de Mato Grosso, Campus Universitário de Alta Floresta, MT, Brasil, e os rizomas de Z. officinale foram coletados em março de 2018, no sítio Bom Sucesso, município de Alta Floresta, Mato Grosso, nas coordenadas 9°49140.58''S e 55°53'08.88''W.

O município de Alta Floresta dista 797 km da capital do Estado, Cuiabá, e abrange uma área de 8.953,191 km², o clima é do tipo Am (tropical ou subúmido), caracterizado por apresentar temperaturas superiores à 18 °C, sendo a temperatura média acima de 26 °C, enquanto a estação seca é de curta duração e o período chuvoso apresenta elevados índices de precipitação pluviométrica, variando entre 2500 e 3100 mm, anualmente.^(12,13)

Obtenção dos extratos

Foram preparadas cinco concentrações de extratos aquosos do tipo infuso (EAI) e decocto (EAD) a partir dos rizomas coletados. Utilizando 90 g de rizoma de Z. officinale in natura e 900 mL de água destilada obteve-se o extrato de maior concentração (100 mg/mL) e a partir da diluição deste foram obtidas as demais concentrações (6,25;12,5; 25 e 50 mg/mL).

O extrato aquoso do tipo infuso foi obtido a partir do aquecimento da água até o ponto de fervura (100 ºC), sendo a mesma vertida sobre as frações do rizoma. O extrato foi abafado e deixado em repouso por 10 min, sendo posteriormente filtrado e diluído nas concentrações de uso. Para obtenção do extrato aquoso do tipo decocto, a água, juntamente com frações de rizoma, foi aquecida e mantida a 100 °C por cinco min. Em seguida, o extrato ficou em repouso e, ao atingir a temperatura ambiente, foi filtrado e diluído.

Para obtenção do extrato bruto hidroalcoólico (EHA), os rizomas de Z. officinale foram fragmentados e secos em estufa (60 ºC) com ventilação, triturados e macerados por 7 dias em etanol 70 %. Após este período, o extrato foi filtrado e concentrado em rotaevaporador sob pressão reduzida (600 mmHg) a 40 ºC. O extrato obtido foi então, liofilizado para obtenção do pó.⁽¹⁴⁾

Para utilização no teste A. cepa, 7,2 g do EHA foi diluído em 900 mL de água destilada para obtenção da concentração 8 mg/mL, a partir da qual, por meio de diluição, foram preparadas as demais concentrações (0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg/mL).

Teste Allium cepa L.

O teste A. cepa foi realizado de acordo com a metodologia de Fiskesjö (1985),⁽¹¹⁾ com alterações propostas por Babich e colaboradores.⁽¹⁵⁾ Foram utilizados 80 bulbos de A. cepa submetidos ao tratamento descontínuo, onde os bulbos foram previamente colocados em água destilada para emissão de raízes e, 36 h depois, quando as mesmas mediam aproximadamente 10 mm, foram transferidos para os extratos a serem testados.

Os bulbos de A. cepa, foram expostos a cinco concentrações de extratos aquosos do tipo infuso e decocto (6,25; 12,5; 25; 50 e 100 mg/mL) e de extrato hidroalcoólico (0,5; 1,0; 2,0; 4,0 e 8,0 mg/mL), sendo que a água destilada foi utilizada como controle negativo, e o glifosato, diluído a 1 %, como controle positivo.

O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado (DIC) e os bulbos organizados em um esquema fatorial 3 x 5 + 2, sendo três tipos de extrato (EAI, EAD e EHA), cinco concentrações e dois tratamentos controle (água destilada e glifosato 1 %), com 5 repetições cada. Os bulbos foram mantidos em câmara de germinação do tipo B.O.D. (Biochemical Oxygen Demand), onde permaneceram em temperatura controlada (25 °C ± 2) e na ausência de luz por 48 horas. Após este período, foram selecionadas, ao acaso, e mensuradas, com auxílio de paquímetro digital, 10 raízes de cada concentração dos EAI, EAD e EHA, assim como dos controles.

Em seguida, foram coletadas, aleatoriamente, raízes de cada concentração dos extratos avaliados e fixadas em solução de Carnoy (3:1, etanol: ácido acético) por 24 horas em temperatura ambiente, sendo então transferidas para etanol 70 % e armazenadas sob refrigeração (± 4 °C) até o uso.

O potencial citotóxico foi avaliado a partir do crescimento das raízes e da análise do índice mitótico (IM), enquanto que o potencial genotóxico foi avaliado a partir da frequência de alterações cromossômicas e/ou anormalidades nas fases da divisão celular. Na preparação das lâminas para avaliação do potencial citotóxico e genotóxico, as raízes foram lavadas em água destilada por cinco minutos, hidrolisadas em HCl 1N por 15 minutos e, novamente lavadas em água destilada por cinco minutos. Para confecção de cada lâmina, utilizou-se o meristema apical de uma das raízes armazenadas, sendo este corado com, aproximadamente, 100 µL de orceína acética 2 %. Com auxílio de um bastão de vidro o meristema foi levemente pressionado e, posteriormente, coberto com lamínula.

Para avaliação do IM foram preparadas oito lâminas por concentração de cada um dos extratos avaliados, assim como dos controles negativo e positivo. Foram analisadas 250 células por lâmina, totalizando 2000 células por tratamento e 10.000 células por extrato. As lâminas foram observadas com microscópio óptico Bioval, em magnitude de 400X, pelo método de varredura, sendo que para cada lâmina foi registrado o número de células em cada fase do ciclo celular (intérfase, prófase, metáfase, anáfase e telófase), bem como, quando presentes, as alterações em cada uma delas. O registro fotográfico foi realizado utilizando uma câmera CMOS (1.3 MP) digital, colorida, acoplada ao microscópio e para captura e edição de imagem utilizou-se o software TSview.

O índice mitótico (IM) foi obtido por meio da equação IM = (nº de células em mitose/nº de células observadas) x 100. A normalidade dos dados foi verificada a partir do teste de Lilliefors. Antes de serem submetidos às análises, os resultados referentes à variável IM foram transformados em Arco Seno √(x/100), onde x representa o percentual de células em mitose.⁽¹⁶⁾ Os dados foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5 % de probabilidade. Para o fator concentração dos extratos foram ajustadas regressões polinomiais, sendo que a escolha do modelo foi feita com base no maior valor do coeficiente de determinação (R²) e no menor desvio. As analises estatísticas foram realizadas com auxílio do programa Genes^®.

RESULTADOS

Os bulbos de A. cepa responderam de forma distinta tanto aos extratos quanto às concentrações testadas e o aumento na concentração dos extratos promoveu efeito negativo no processo de crescimento radicular (Figura 1).

A análise de variância indicou efeito significativo dos diferentes extratos de Z. officinale sobre o desenvolvimento do sistema radicular de A. cepa. Para os extratos aquosos do tipo infuso e decocto, a concentração de 100 mg/mL promoveu resposta similar ao controle positivo quanto a redução no comprimento da raiz, enquanto que para o extrato hidroalcoólico, esta resposta ocorre a partir da concentração de 4,0 mg/mL (Figura 2).

A análise de variância indica efeito significativo dos extratos de Z. officinale sobre o índice mitótico (IM) em A. cepa. Ao comparar as médias dos IM entre os tratamentos, constata-se diferença estatística entre os resultados obtidos para todos os extratos e o controle negativo, evidenciando a inibição da divisão celular e o efeito antiproliferativo dos extratos de Z. officinale, sendo o extrato hidroalcoólico o que apresenta maior citotoxicidade (Tabela).

Médias e desvio padrão seguidos pelas mesmas letras não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p< 0,05). ¹Água destilada; ²Glifosato 1 %; E.A.: Extrato aquoso. E.: Extrato.

Além do método de extração, a concentração do extrato utilizado também atua sobre o metabolismo celular (Figura 3).

Não foram observadas anormalidades ou aberrações nas células meristemáticas submetidas ao extrato aquoso do tipo infuso, enquanto para o decocto foram registradas três células com pontes anafásicas (50 mg/mL) e para o hidroalcoólico, um total de 15 células com metáfase irregular (distribuídas em todas as concentrações) e três células com ponte anafásica (0,5; 1,0 e 2,0 mg/mL) (Figura 4).

DISCUSSÃO

Todos os extratos e concentrações testadas neste estudo tiveram efeito antiproliferativo sobre as células meristemáticas de raízes de A. cepa, sendo que a redução do índice mitótico (IM) foi diretamente proporcional ao aumento na concentração dos extratos testados.

A utilização do teste A. cepa em ensaios toxicológicos permite a análise da citotoxicidade por meio de parâmetros macroscópicos , como a cor, o formato e o comprimento da raiz, e também de parâmetros microscópicos, como alterações no índice mitótico e aberrações cromossômicas.⁽¹⁾

O crescimento radicular é produto da intensa atividade mitótica que ocorre no tecido meristemático e, subsequente, alongamento das células por ela originadas.⁽⁹⁾ A redução no comprimento das raízes permite inferir que os extratos inibiram o processo de divisão celular, o que foi corroborado pela análise microscópica, com avaliação do índice mitótico, que expôs a redução do número de células em divisão.

O índice mitótico é um dos parâmetros utilizados para avaliar o potencial citotóxico de extratos vegetais, onde resultados que divergem daqueles apresentados pelo controle negativo indicam a ação de compostos químicos sobre o ciclo celular, seja inibindo-o ou estimulando-o.

A maior atividade antiproliferativa do extrato hidroalcoólico (EHA) constatada neste estudo pode estar relacionada ao processo de extração, uma vez que o EHA é mais eficiente na degradação da parede celular e da membrana plasmática, potencializando a extração, especialmente, de polifenóis, flavonoides e outros compostos orgânicos. Além disso, ainda é preciso considerar que as altas temperaturas utilizadas na obtenção de EAI e EAD podem provocar mudanças estruturais irreversíveis em substâncias termolábeis.^(17,18,19)

A diferença de potencial antiproliferativo entre os extratos avaliados indica que a metodologia utilizada na preparação dos extratos está diretamente relacionada à sua capacidade de ação. Ao definir a metodologia, é necessário considerar os diversos fatores que influenciam a eficiência na extração dos compostos bioativos, como a parte vegetal, a temperatura e o solvente utilizado, sendo este diretamente relacionado à especificidade do composto que se pretende extrair. Dentre os diversos métodos de extração estão a infusão, a decocção e a maceração, onde o solvente pode ser a água ou o etanol.^(17,20)

Os resultados deste estudo confirmam que extratos obtidos a partir de uma mesma planta, e até da mesma estrutura vegetal, podem promover respostas diferenciadas de acordo com o método utilizado. As alterações no índice mitótico promovidas pelos extratos de Z. officinale diferiram estatisticamente entre si, sendo que quando comparado com o EAI, o EAD exerceu maior efeito inibitório sobre o índice mitótico. A diferenças entre os extratos aquosos pode ser explicada pela escolha do material vegetal, pois extratos do tipo decocto são mais eficazes na extração de metabólitos de partes relativamente duras e resistentes da planta, como o rizoma, enquanto o infuso se mostra mais eficiente na extração de partes tenras do vegetal, como as folhas.⁽²¹⁾

Já os resultados obtidos para o extrato hidroalcoólico podem estar relacionados ao solvente utilizado, uma vez que, sendo uma solução anfifílica, possibilita a extração de compostos polares e apolares,⁽¹⁸⁾ ou seja, de compostos que seriam extraídos tanto por extratos aquosos quanto por extratos etanólicos. Outros fatores que devem ser considerados são a temperatura mais amena, a superfície e o tempo de contato entre o solvente e o Z. officinale em pó.

Estes resultados permitem inferir que extratos de Z. officinale, nas condições aqui utilizadas, possuem potencial citotóxico. Dias e colaboradores⁽²²⁾ e Silva e colaboradores,⁽²³⁾ ao avaliar os efeitos de extratos de plantas utilizadas pela medicina tradicional sobre o ciclo celular de A. cepa, obtiveram resultados semelhantes ao deste estudo, evidenciando que fitoterápicos podem interferir no processo de divisão celular.

O potencial antiproliferativo de plantas e seus derivados têm sido explorados em pesquisas relacionadas ao tratamento e prevenção de câncer, uma vez que, ao inibir o processo de divisão celular, pode ter efeito significativo sobre o crescimento do tumor e também da metástase.^(24,25,26)

O Z. officinale utilizado principalmente como condimento e como fitoterápico no tratamento de problemas gastrointestinais e respiratórios, bem como no controle dos níveis de colesterol e glicose,^(27,28) todavia, estudos recentes exploram o potencial dos compostos químicos da espécie no tratamento e prevenção de diferentes tipos de câncer.^(7,8,25)

Os resultados obtidos com este estudo permitem concluir que o extrato hidroalcoólico e os extratos aquosos, infuso e decocto, de Z. officinale avaliados possuem potencial citotóxico sobre células meristemáticas de A. cepa, sendo sua eficiência influenciada diretamente pela metodologia empregada, solvente e concentrações utilizadas. A baixa frequência de células com alterações cromossômicas, no entanto, indica que os mesmos extratos não apresentam potencial genotóxico.

O potencial citotóxico de extratos de Z. officinale detectado neste estudo reafirma a necessidade de pesquisas para identificação dos fitoquímicos presentes em plantas utilizadas como condimentos ou como medicinais, bem como sua toxicidade, sendo estas informações fundamentais para orientação quanto ao uso adequado destas plantas e para o direcionamento de pesquisas voltadas para produção de medicamentos.

A ação antiproliferativa de Z. officinale sobre o ciclo celular de A. cepa indica que trata-se de uma espécie promissora como alimento funcional e também para o tratamento de tumores, entretanto, são necessários mais estudos relacionados tanto a este mecanismo de ação quanto ao seu potencial como antimutagênico, a eficiência na extração e no isolamento e utilização de seus compostos bioativos.

Agradecimentos

À Secretaria de Educação do Estado de Mato Grosso (SEDUC/MT), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à Fundação de Amparo à Pesquisa do Mato Grosso (FAPEMAT), à Universidade do Estado de Mato Grosso (UNEMAT) e ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Agroecossistemas Amazônicos, UNEMAT.

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Contribuição dos autores

Elisa dos Santos Cardoso: Implantação e avaliação do experimento, análise dos dados, redação.

Ana Aparecida Bandini Rossi: Análise de dados, redação e revisão.

Eliane Cristina Moreno de Pedri, Vinícius Delgado da Rocha, Alex Souza Rodrigues, Patrícia Ana de Souza Fagundes: Implantação do experimento, análise de dados e redação.

Conflicto de intereses

Los autores plantean que no tienen conflicto de intereses.